铜绿假单胞菌生物被膜诱导肺泡上皮细胞分泌炎性细胞因子的研究

王 非 王 媛 赵 玮 骆仙芳 浙江中医药大学附属第一医院 杭州 310006

铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa）是引起多脏器医院感染的常见病原菌之一，能形成生物被膜，易在慢性支气管炎、支气管扩张等原有肺部慢性病变基础上引起肺部反复感染并纤维化[1]。有证据显示，铜绿假单胞菌生物被膜可能是引起该菌感染引起肺纤维的化主要因素[2-3]。然而，铜绿假单胞菌生物被膜如何诱导肺纤维化机制不明。我们采用铜绿假单胞菌生物被膜作用人肺上皮细胞，检测其分泌炎症细胞因子的情况，探讨铜绿假单胞菌生物被膜在感染性纤维化中作用，以期为阐明铜绿假单胞菌生物被膜诱导的感染性肺纤维化提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源及培养 铜绿假单胞菌ATCC27853株购自北京中国药品生物制品检定所。将细菌接种于LB琼脂平板上（Sigma），挑取单个菌落接种至 5mL LB培养液中，37℃、210r/min旋转培养12～16h。取lmL菌液10 000r/min离心 3min，取沉淀用0.01mol/L PBS（pH7.4）洗涤、离心2次。细菌沉淀用 lmL PBS重悬，经麦氏比浊法测定菌液浓度后用PBS配制成5×108CFU/mL菌液。

1.2. 细胞株及培养 人肺上皮细胞株A549购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库。上述细胞培养于含10%胎牛血清（FCS，GiBco）、100 U/mL青霉素（Sigma）、100 U/mL链霉素（Sigma）的DMEM（GiBco）培养基中，37℃、5%CO2条件下培养2～3 天传代。

1.3 铜绿假单胞菌生物被膜藻酸盐的纯化 铜绿假单胞菌ATCC27853株接种在LB琼脂平板上，37℃培养7天。刮取培养物悬于PBS中，17 000r/min，4℃离心30min，上清液用花板0.22μm滤膜过滤去除残留菌体，100℃水浴30min使蛋白变性，17 000r/min，4℃离心30min，用80%的乙醇将其中的藻酸盐沉淀。藻酸盐粗提物溶解于含有10mM的MgCL2和1mM的CaCL2的PBS中，加入100μg/mL RNase A（Sigma）和100μg/mL Type IV DNase I （Sigma），37℃作用4h，水解其中的RNA和DNA，然后于80℃加热30min，使酶变性。17 000r/min、25℃离心30min后，上清液再用80%的乙醇沉淀。沉淀物用0.025M的碳酸铵溶解后加到DEAE-TOYO-PEARAL 650S（Tosoh）层析柱上并用0.025M到1.0M的碳酸铵溶液洗脱，洗脱的组分（每试管5mL）用卡巴唑-硼酸法测定其中的藻酸盐含量。收集藻酸盐含量≥100μg/mL 试管中的洗脱液，PBS中透析48h，更换PBS 3次，得到的藻酸盐再与AFFI-Preppolymyxin（Bio-Rad）混合搅拌24h，17 000r/min，25℃离心30 min，弃含脂多糖AFFIPreppolymyxin沉淀，取上清真空旋转干燥。

1.4 炎性细胞因子检测 96孔细胞培养板中每孔接种1×104A549细胞，37℃、5%CO2条件下培养12h使成单层细胞。参考文献及预实验结果分别用悬浮于无抗生素2.5%FCS DMEM铜绿假单胞菌生物被膜 盐（10 μg/mL）感染各细胞，37℃，5%CO2继续培养，3、6、12、24、48 h收集上清，用细胞因子ELISA定量检测试剂盒（RapidBio Lab）检测白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-8（IL-8）和肿瘤坏死因子（TNF-α）表达量。不同作用时间均重复3孔。实验中用非感染正常细胞作为对照（2.5%FCS DMEM）。

1.5 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件分析处理数据，所得结果用（±s）表示。采用t检验，方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 铜绿假单胞菌生物被膜藻酸盐诱导A549细胞分泌IL-1β的作用 受铜绿假单胞菌生物被膜藻酸盐作用12h后，A549细胞分泌IL-1β水平开始增高，并在48h内持续升高，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 藻酸盐作用后A549细胞上清中IL-1β的浓度变化（± s） pg/mL

表1 藻酸盐作用后A549细胞上清中IL-1β的浓度变化（± s） pg/mL

注：与空白对照组比较：△P＜0.05

组 别 n/孔 3 h 6 h 12 h 24 h 48 h藻酸盐组(10μg/mL) 3 66.8±6.9 66.2±7.1 150.6±13.3△ 185.1±15.1△ 256.8±18.8△空白对照组（2.5%FCS DMEM） 3 67.1±7.6 67.4±6.3 68.8±7.2 71.0±8.1 70.4±7.6

2.2 铜绿假单胞菌生物被膜藻酸盐诱导A549细胞分泌IL-6的作用 受铜绿假单胞生物被膜藻酸盐作用6h后，A549细胞分泌IL-6的表达量开始增高，至24h达到高峰，此后开始下降，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 藻酸盐作用后A549细胞上清中IL-6的浓度变化（± s） pg/mL

表2 藻酸盐作用后A549细胞上清中IL-6的浓度变化（± s） pg/mL

注：与空白对照组比较：△P＜0.05

组 别 n/孔 3 h 6 h 12 h 24 h 48 h藻酸盐组(10μg/mL) 3 53.6±7.3 136.1±14.4△ 171.5±14.8△ 205.1±24.2△ 176.8±17.6△空白对照组（2.5%FCS DMEM） 3 56.2±8.6 57.4±9.2 54.8±8.2 61.0±8.1 60.4±8.6

2.3 铜绿假单胞菌生物被膜藻酸盐诱导A549细胞分泌IL-8的作用 受铜绿假单胞生物被膜藻酸盐作用12h后，A54细胞分泌IL-8的量开始增高，24h达到高峰，此后有所下降，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 藻酸盐作用后A549细胞上清中IL-8的浓度变化（± s） pg/mL

表3 藻酸盐作用后A549细胞上清中IL-8的浓度变化（± s） pg/mL

注：与空白对照组比较：△P＜0.05

组 别 n/孔 3 h 6 h 12 h 24 h 48 h藻酸盐组(10μg/mL) 3 92.1±11.7 96.2±10.7 195.0±19.0△ 210.8±16.6△ 124.2±15.0△空白对照组（2.5%FCS DMEM） 3 99.1±12.9 101.3±10.6 102.1±11.9 125.8±13.0 100.4±12.6

2.4 铜绿假单胞菌生物被膜藻酸盐诱导A549细胞分泌TNF-α的作用 受铜绿假单胞生物被膜藻酸盐作用6h后，A549细胞分泌TNF-α的量开始增高，并在48 h内持续升高，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表4 铜绿假单胞菌作用后A549细胞上清中TNF-α浓度变化（± s） pg/mL

表4 铜绿假单胞菌作用后A549细胞上清中TNF-α浓度变化（± s） pg/mL

注：与空白对照组比较：△P＜0.05

组 别 n/孔 3 h 6 h 12 h 24 h 48 h藻酸盐组(10μg/mL) 3 29.5±3.9 67.5±5.9△ 100.1±7.6△ 155.3±13.6△ 233.2±13.5△空白对照组（2.5%FCS DMEM） 3 28.4±4.1 27.8±3.8 29.9±3.5 30.9±3.9 29.3±3.7

3 讨论

一些病原微生物感染常可引起肺纤维化，感染引起的肺纤维化往往是肺部反复感染的结果，或病原微生物感染作为促进因素导致其它原因引起的肺纤维化迅速发展。铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa）是引起医院感染的常见病原菌之一，80%～90%肺囊性纤维化病人肺组织标本中检出铜绿假单胞菌或其被膜菌[4]。迄今肺纤维化发生机制研究进展，主要体现在肺纤维化相关细胞及其细胞因子领域，甚至有人提出了肺纤维化发病的肺组织细胞与细胞因子网络学说[5]。其主要内涵为：肺泡上皮细胞、肺间质细胞、单核-巨噬细胞是参与肺纤维化主要细胞，上述细胞均可分泌IL-1β、TNF-α、转化生长因子（TGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）等，在肺纤维化发生和发展过程中发挥重要的作用[6-10]。

本研究参考文献报道的方法[11-12]，体外诱导铜绿假单胞菌形成生物被膜，采用乙醇沉淀法提取细菌被膜并纯化。选用人肺泡Ⅱ型上皮细胞株A549为靶细胞，分别检测在铜绿假单胞菌生物被膜藻酸盐作用后上皮细胞分泌炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α表达情况，探讨其在感染性纤维化中作用。研究结果发现，A549细胞在铜绿假单胞菌生物被膜藻酸盐作用后其分泌IL-1β和TNF-α水平48 h内持续升高，但IL-6和IL-8则在作用后24 h达到高峰，之后有所下降。提示铜绿假单胞菌生物被膜藻酸盐均可促A549诱生上述4种炎性细胞因子的能力增强，但其诱导分泌的TNF-α、IL-1β水平则呈现为持续性增高，而IL-6、IL-8细胞因子水平升高呈一过性。本研究结果提示肺部反复感染铜绿假单胞菌形成生物被膜，可能首先作用于肺泡上皮细胞，靶细胞启动相关信号传导通路，上调IL-1β、IL-6、IL-8 、TNF-α等炎性细胞因子表达，促进肺泡炎症，进而诱导肺组织中成纤维细胞活化、增殖及转化，从而促进肺纤维化形成。

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