小青龙汤对哮喘炎性反应的作用及其机制探讨

王 伟 张 狄 浙江中医药大学第三临床医学院 杭州 310053周大兴 刘 瑶 浙江中医药大学药学院

支气管哮喘是由IgE介导的，多种炎症细胞、炎症介质和细胞因子参与形成的慢性气道炎症。嗜酸性粒细胞（EOS）是哮喘炎症的关键细胞，通过释放GM-CSF、IL-5等多种细胞因子发挥延迟凋亡、增加浸润的作用从而维持呼吸道炎症的存在。本实验拟通过建立豚鼠过敏性哮喘模型，观察小青龙汤对哮喘豚鼠血清IgE水平和肺组织IL-5和GM-CSF基因表达量的影响，探讨其缓解哮喘气道炎症反应的作用机制。

1 材料

1.1 实验动物 健康雄性荷兰种豚鼠48只，体重（200±10）g，普通级。浙江中医药大学实验动物中心提供，合格证号码：SCXK(沪)2008-0016。

1.2 药品与试剂 小青龙颗粒（湖北纽兰药业有限公司，批号20090201）；氨茶碱注射液（天津金耀氨基酸有限公司，批号200805122）；GradeⅡ卵清蛋白（北京生物技术有限公司，批号9006-59-1）；Guinea pig IgE ELISA kit（美国R＆D Systems，批号20091222）；TaKaRa RNAiso plus ，TaKaRa primescriptTMRT-PCR kit， TaKaRa Agarose MS-6（宝生物工程有限公司）；DEPC（美国sigma分装，批号20071006）；引物由上海生工生物工程技术服务公司合成，各引物基因序列：β-actin上游引物 5’-TGCTGTCCCTGTATGCCTCTG-3’，下游引物5’-GAGGTCCTTACGGATGTCAACG-3’，产物长度为464bp；IL-5上游引物5’- AGCTCTGGCAACACTATTCC-3’，下游引物5’-GGTCTCAGCCTTCAATTGTC-3’，产物长度为163bp；GM-C S F上游引物 5’-ATGCCACCATCAATGAAGCC-3’，下游引物5’-CAAAAGGGATAGCAAACAGAA-3’，产物长度为307bp。

1.3 实验仪器 402型超声雾化器（上海四菱医疗器械厂）；DRP-9162型电热恒温培养箱（上海森信实验仪器有限公司）； JY92-超声波细胞粉碎机/隔音箱（宁波新芝生物科技股份有限公司）；LAS 4000 ImageQuant（日本富士公司）；S1000TM Thermal Cycler（美国BIO RAD公司）；AllegraTM64R Centrifuge（美国贝克曼库尔特有限公司）；Forma -86C ULT Freezer（Thermo ELECTRON CORPORATION）；PAC 300多功能水平电泳槽（美国BIO RAD公司）；680型酶标仪（美国BIO RAD公司）；核酸蛋白分析仪（美国BIO RAD公司）。

2 实验方法

2.1 分 组 健康雄性荷兰种豚鼠48只，随机分为6组：正常对照组、哮喘模型组、氨茶碱组、小青龙汤高剂量组、小青龙汤中剂量组、小青龙汤低剂量组，每组8 只。

2.2 模型制备与给药[1]实验第1天，除正常对照组外，其他5组动物分别一次性腹腔注射10%OVA 1mL致敏，正常对照组用生理盐水代替。各给药组自致敏后一天起，至最后一次激发当天，每天灌胃给药治疗，共17天。氨茶碱组予氨茶碱注射液，50mg/kg；小青龙汤高剂量组予小青龙颗粒溶液，4.5g/kg；小青龙汤中剂量组予小青龙颗粒溶液，1.5g/kg；小青龙汤低剂量组予小青龙颗粒溶液，0.5g/kg；哮喘模型组和空白对照组给予生理盐水灌胃治疗。

第15天开始，除正常对照组外，其余各组在给药1h后吸入1%OVA超声雾化液引喘，以出现烦躁、呛咳、明显的腹肌收缩、点头呼吸为哮喘指征；空白对照组用生理盐水激发，每天1次，共3天。

2.3 血清IgE含量测定 各组动物于末次激发后，3%戊巴比妥纳 1.5mL/kg腹腔注射麻醉，下腔静脉取血，于高速冷冻离心机3000r/min，离心15min后，取上清，酶联免疫吸附法检测血清中IgE含量。具体操作按照试剂盒说明书进行，于450nm处测定。

2.4 肺组织IL-5和GM-CSF基因表达量测定[2]各组动物于末次激发后，3%戊巴比妥纳 1.5mL/kg腹腔注射麻醉，打开胸腔， 分离气管和肺脏，取下肺叶，盐水洗去残血，滤纸吸干。取左肺于-80℃冰箱保存待用。

2.4.1 肺组织总RNA提取 取约100mg豚鼠肺组织于1.5mL Eppendorf管中，迅速加入1.0mL的

Trizol溶液，将组织超声粉碎后，静置5min。①每1mLTrizol中加0.2mL氯仿。盖紧样品管盖，颠倒混匀后，12 000rmp离心15min；②将上层水相转入新的1.5mLEP管中（350μL），加入等体积异丙醇，混匀后12 000rmp离心10min；③倒掉上清，留取沉淀。加入0.5mL现配的75%的乙醇（DEPC-H2O配制共1mL，预冷），盖紧盖子后摇晃管子，使沉淀悬浮于乙醇中，7 500rmp离心5min；④倒掉上清，留取沉淀，置于吸水纸上吸干残余液体并使其自然干燥。再在管中加50μL的0.1%DEPC水溶解；⑤新的1.5mLEP管中加入590μL DEPC处理水，另加入已溶解的RNA溶液10μL（稀释60倍），混匀后核酸蛋白分析仪测定RNA含量以及260nm和280nm下吸光度值，并计算比值。

2.4.2 逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）法扩增IL-5、GM-CSF基因 取总RNA，按照RT-PCR试剂盒说明书进行内参基因β-actin 和目的基因IL-5、GM-CSF 的扩增。反应结束后将目的基因扩增产物7μL和内参基因扩增产物3μL进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结果采用凝胶图像处理系统对条带扫描，并用Image-Proplus 5.0 软件进行半定量分析：目的基因相对表达量=平均目的基因条带光强度/平均内参基因条带光强度。

2.5 统计学方法 数据用（±s）表示，选用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 小青龙汤对哮喘豚鼠血清中IgE含量的影响与模型组相比，小青龙汤低剂量和中剂量组血清中IgE的含量显著降低（P＜0.05）；而小青龙汤高剂量组血清中IgE含量降低更为显著（P＜0.01），其作用程度与氨茶碱组相似。但与正常对照组相比，小青龙汤低剂量组和中剂量组虽然降低了血清中IgE的含量，但仍未恢复正常水平；而小青龙汤高剂量组血清中IgE的含量降至正常。小青龙汤降低血清中IgE含量的作用呈浓度依赖性，见表1。

表1 小青龙汤对哮喘豚鼠血清IgE含量的影响（±s） μg/L

表1 小青龙汤对哮喘豚鼠血清IgE含量的影响（±s） μg/L

注：与正常对照组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05,△△P＜0.01

组 别 n/只 IgE正常对照组 8 53.93±6.16模型组 8 107.20±15.68*氨茶碱组 8 54.09±8.22△小青龙汤低剂量组 8 79.01±13.98*△小青龙汤中剂量组 8 67.47±7.86*△小青龙汤高剂量组 8 52.56±7.00△△

3.2 小青龙汤对哮喘豚鼠肺组织中IL-5 mRNA、GM-CSF mRNA表达的影响 与模型组比较，小青龙汤低剂量和中剂量组可降低IL-5基因表达，差异有统计学意义（P＜0.05），小青龙汤高剂量组降低了IL-5基因表达量更为显著（P＜0.01），其作用程度与氨茶碱组相似；小青龙汤各剂量对降低GM-CSF基因表达的作用具有显著性差异（P＜0.05），其作用程度与氨茶碱相似。但与正常对照组比较，小青龙汤低剂量组虽然降低了IL-5基因和GM-CSF基因的表达量，但仍未降至正常水平；而小青龙汤中、高剂量组的IL-5基因和GM-CSF基因的表达水平降至正常量。提示小青龙汤有抑制IL-5基因和GM-CSF基因表达量的作用，且作用呈浓度依赖性，见表2、图1、2。

表2 各组肺组织中IL-5和GM-CSF mRNA表达量（± s，n=3）

表2 各组肺组织中IL-5和GM-CSF mRNA表达量（± s，n=3）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

IL-5 mRNA表达量 GM-CSF mRNA 表达量组 别 IL-5 β-actin 相对强度 GM-CSF β-actin 相对强度（强度） （强度） （强度） （强度）正常对照组 131 71 1.8547±0.2584 107 50 2.1320±0.0409模型组 158 52 3.0644±0.1276** 165 54 3.0383±0.2495*氨茶碱组 130 73 1.8018±0.2566△△ 113 53 2.145±0.1937△△小青龙汤低剂量组 124 47 2.6408±0.1760**△ 140 54 2.6014±0.1627*△小青龙汤中剂量组 116 53 2.2620±0.3659△ 124 52 2.3598±0.0757△小青龙汤高剂量组 128 71 1.7954±0.1766△△ 106 47 2.2635±0.3131△

图1 各组IL-5和β-actin mRNA的表达（从左到右marker、模型组、正常对照组、氨茶碱组、小青龙汤低剂量组、中剂量组、高剂量组）

图2 各组GM-CSF和β-actin mRNA的表达（从左到右小青龙汤高剂量组、中剂量组、低剂量组、氨茶碱组、模型组、正常对照组、marker）

4 讨论

支气管哮喘是由免疫球蛋白E(IgE)介导、多种炎性细胞参与的气道慢性炎症。目前认为嗜酸性粒细胞（EOS）是气道变应性炎症反应的主要效应细胞，其他细胞多数通过EOS 而产生效应。近年研究发现EOS 聚集增加和凋亡延迟是肺内EOS 浸润的重要因素，而减少肺内EOS 浸润则促进哮喘气道炎症的消退[3-5]。

EOS能通过自分泌形式产生粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、白介素5（IL-5）、白介素3（IL-3）等多种细胞因子，从而增强细胞活力，延迟细胞凋亡发生，导致EOS数量增多、呼吸道炎症持续存在。其中GM-CSF和IL-5协同参与调节EOS成熟、分化、活化、脱颗粒及凋亡等过程，在哮喘气道炎症的形成和维持中发挥重要作用[6]。

小青龙汤是《伤寒论》治疗喘证的良方之一。全方由麻黄、桂枝、半夏、芍药、干姜、细辛、五味子、炙甘草组成，具有解表散寒、温肺化饮功效，目前临床上广泛用于治疗过敏性哮喘、支气管哮喘急性发作。本研究中，相较正常组，小青龙汤治疗组可降低血清IgE含量和IL-5、GM-CSF基因的表达量。本实验结果说明小青龙汤可通过降低IgE含量和IL-5、GM-CSF基因的过度表达，减少肺内EOS的浸润，减轻IgE介导的气道炎症反应。

[1]沈惠风,刘烨,王利民,等.中药敷贴对哮喘豚鼠肺组织IL-5 mRNA和IL-10 mRNA表达的影响[J].上海中医药大学学报, 2009, 23（5）：55-57.

[2]方向明,王军平.平喘宁对哮喘豚鼠肺组织中GMCSFmRNA表达的影响 [J].中华中医药杂志, 2005, 20（9）：538-541.

[3]罗英琳.嗜酸性粒细胞凋亡在哮喘中的作用[J].右江民族医学院学报, 2002, 24（3）：436.

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[6]张伟,钟南山,徐军,等.支气管哮喘患者粒巨噬细胞集落刺激因子mRNA表达的研究 [J].中华结核和呼吸杂志, 2000, 23：2124.