红花药材黄色素类成分的HPLC指纹图谱研究Δ

李雪莹，武永刚（山东中医药高等专科学校，烟台市 264100）

红花为菊科植物红花Carthamus tinctoriusL.的管状花，为活血化瘀的主要中药之一，用于治疗冠心病、脑血栓等心脑血管疾病[1]。目前对红花有效部位的研究主要集中在查尔酮类化合物红花黄色素（safflower yellow，SY）上。SY是一种复杂的水溶性混合物，在干花中含量占20%～30%，目前报道的SY类成分中主要有羟基SYA、SYB、SYC、SYA、Safflomin A、Safflomin B、Safflomin C、tinctorimine、precarthamin等，红花的活血化瘀等功能多与这一类化合物有关[2]。笔者通过反相高效液相色谱（RP-HPLC）法建立了红花药材中SY类成分的指纹图谱分析方法，以期为红花的鉴别和质量控制提供依据。

1 仪器与试药

1100型HPLC仪，包括四元梯度泵、DAD紫外检测器（美国Agilent公司）。

乙腈（色谱纯，德国Merck公司）；三氟乙酸（分析纯，南开大学精细化学实验厂）；甲醇（色谱纯，天津市大茂化学试剂厂）；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司，使用前经0.45 μm水系滤膜过滤）；羟基SYA对照品（中国药品生物制品检定所，批号：111637-200301）；红花为菊科植物红花C.tinctoriusL.的干燥花瓣，由本校张钦德教授鉴定为真品，其商品药材编号S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10分别来源于四川、江苏、辽宁、黑龙江、山东、吉林、内蒙古、北京、河南、新疆。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：25℃；流速：1.0 mL·min-1；流动相：乙腈（A）-0.01%三氟乙酸溶液（B），梯度洗脱（0～25 min，2%～10%A；25～35 min，10%～15%A；35～65 min，15%～25%A；65～70 min，25%A）；分析时间：70 min；检测波长：403 nm；进样量：20 μL。

2.2 供试品溶液的制备

称取红花药材粉末5 g，加12倍量水浸泡30 min，于60℃下温浸1 h，滤过；滤渣再加10倍量水，继续温浸1 h，滤过，合并滤液减压浓缩至提取液含生药1 g·mL-1。加入95%乙醇使含醇量达到80%，醇沉24 h，取续滤液作为供试品溶液。

2.3 对照品溶液的制备

精密称取羟基SYA对照品适量，置50 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，制成含羟基SYA0.6 mg·mL-1的对照品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取供试品溶液（编号：S10）适量，连续进样6次，按“2.1”项下色谱条件进样测定。结果，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积基本没有明显变化，RSD均＜3%，表明方法精密度良好，符合指纹图谱技术要求。

2.4.2 稳定性试验 取供试品溶液（编号：S10）适量，分别在配制后0、3、6、9、12和24 h进样，按“2.1”项下色谱条件进样测定。结果，各共有峰相对保留时间的RSD均＜0.36%，相对峰面积的RSD均＜2.53%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.3 重复性试验 取同一批（编号：S10）红花药材适量，共6份，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.1”项下色谱条件进样测定。结果，各色谱峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均＜3%，表明方法重复性良好。

2.5 指纹图谱及技术参数研究

2.5.1 HPLC指纹图谱分析 取S1～S10号红花药材样品粉末各适量，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液，各取20 μL进样，得到各样品的指纹图谱。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）”进行色谱峰的匹配和相似度的计算，将10批次样品图谱导入相似度软件，以S10号样品色谱为参照，采用平均计算法，由10批红花药材提取物指纹图谱生成对照指纹图谱（见图1）。以对照指纹图谱为参照，各批样品指纹图谱（见图2）与之进行比较，计算得各批样品指纹图谱相似度值，S1～S10号相似度分别为0.996、0.998、0.995、0.998、0.969、0.995、0.999、0.996、0.999、0.999。所测样品的相似度均在0.9以上，显示10批样品与对照指纹图谱有较高的相似性。

图1 红花药材中SY类成分对照指纹图谱（共有模式）Fig 1 Fingerprints of SY from C.tinctorius（common model）

图2 10批次样品的HPLC指纹图谱Fig 2 HPLC fingerprints of 10 batches of samples

由图2可知，所建立的指纹图谱包含8个主要共有峰，占总峰面积的90%以上。再通过图1可确定3号峰为羟基SYA，含量达到了50%以上，峰面积最大，出峰时间适中，与相邻色谱峰分离良好，被选作参照峰；4号峰表现为多个小峰组成的宽峰，峰形常有变化；7、8号峰未完全分开；其他峰分离较好。2.5.2 不同产地药材指纹图谱比较 相对保留值系统将波动较大的绝对值变为稳定性较好的相对保留值，将整个比较系统处于同一尺度范围内进行比较，提高了样品间的可比性和比较结果的可信性。以图1中3号峰为参照峰，计算各样品指纹图谱中各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。从10个样品指纹图谱分析结果可知，8个共有峰相对保留时间一致，但不同样品相对峰面积的比值相差较大。红花药材中SY类成分共有峰的相对保留时间和相对峰面积分别见表1和表2。

表1 红花药材中SY类成分共有峰的相对保留时间Tab 1 Relative retention time of common peaks of SY from C.tinctorius

3 讨论

3.1 色谱条件的优化

本试验采用RP-HPLC法作为测定红花药材中SY类成分指纹图谱的方法，重复性、稳定性、精密度均较高。由于SY类成分复杂，单一流动相无法达到很好的分离效果，故采用梯度洗脱方式；黄酮类成分含有多个酚羟基，呈弱酸性，故使用酸性缓冲系统；参考相关文献[3]，对不同组成的流动相系统进行了梯度洗脱试验，结果发现当使用乙腈时，基线漂移现象较甲醇轻；对流动相中酸的考察包括：甲酸、乙酸、磷酸、三氟乙酸，结果显示使用三氟乙酸能更好地改善峰形和分离度。在整个分析时间段（70 min）内，各色谱峰达到很好的分离效果且相对保留时间稳定，有利于指纹图谱的分析。

在波长为403 nm时，SY类化合物有最大吸收[4]，所得色谱峰总峰面积较大、分离度较好，故选取403 nm作为检测波长。

表2 红花药材中SY类成分共有峰的相对峰面积Tab 2 Relative peak areas of common peaks of SY from C.tinctorius

3.2 提取条件的选择

提取工艺是影响指纹图谱、反映药材内在化学成分的重要因素之一。本试验以总黄色素和羟基SYA的含量为考察指标进行提取溶剂和提取方法的选择。为了使SY类成分提取完全，根据红花所含成分的性质，采用不同极性的溶剂（纯水和不同浓度的乙醇）和不同的提取方式（温浸、超声和回流）进行提取[5]，并对提取时间进行了单因素试验。结果发现，随着乙醇浓度的增加，SY在提取液中的质量浓度反而降低，且乙醇提取带进的脂溶性杂质较多，因此选择以水作为提取溶剂、60℃下温浸为SY的最佳提取方法；单次提取时间应控制在1 h以内；采取醇沉法以除去水提液中蛋白质、多糖等影响测定的干扰性成分，效果较好。

3.3 不同产地药材指纹图谱相似度评价

由本试验结果可得，10批不同产地来源的红花药材SY类成分的指纹图谱面貌基本一致，相似度良好（r＞0.90），说明不同产地红花药材的SY类成分化学组成一致性较好，质量稳定，可以用来作定性鉴别。但各组分相对含量仍有一定的差异，其中变化较大的为来自于山东的红花药材SY类成分指纹图谱（对应于表2中S5号数据），可以看出差异主要集中在4号和8号峰的峰形及其相对保留值上。

3.4 小结

本方法稳定、可靠、重复性好，可为SY类成分的品质评价和质量控制提供科学依据。SY是一种复杂的水溶性混合物，由于对水溶性部位的成分研究有一定的难度，加之其成分有些不稳定，较难获得单体化合物，故本试验只指认了羟基SYA的色谱峰，其他峰有待进一步研究确定其归属；同时，如果将药理数据与指纹图谱数据相结合，建立谱效关联，可进一步优化指纹图谱，提高红花质量控制的针对性。

[1] 廖 晖，郝一彬.红花注射液对急性心肌缺血大鼠的保护作用及机理探讨[J].中国药房，2003，14（5）：269.

[2] 姜建双.红花化学成分及生物活性研究[D].北京：中国医学科学院，2008.

[3] Fan L，Zhao HY，Xu M，et al.Qualitative evaluation and quantitative determination of 10 major active components inCarthamus tinctoriusL.by high-performance liquid chromatography coupled with diode array detector[J].J Chromatogr A，2009，1 216（11）：2 063.

[4] 高梓真，夏小艳，黄秋月，等.超声法提取红花中红花黄色素的工艺研究[J].哈尔滨医科大学学报，2008，42（6）：560.

[5] 周平兰，夏新华.红花黄色素提取工艺的研究[J].湖南中医学院学报，2004，24（1）：11.