注射用肌萎灵细菌内毒素检查方法的研究Δ

郑亚杰，贾继明，王贵金，刘兴国，蔡艳，宋剑（河北以岭医药研究院，石家庄市050035）

注射用肌萎灵是由人参、淫羊藿药材经加工制备而成的中药注射用无菌粉末制剂，具有治疗运动神经元疾病（肌萎缩侧索硬化、进行性脊肌萎缩、进行性延髓麻痹、原发性侧索硬化）、进行性肌营养不良、先天性肌病等疾病所致的肌肉萎缩及重症肌无力的作用[1]。注射用肌萎灵质量标准中对注射剂采用家兔法进行热原检查，但家兔法进行热原检查操作复杂、时间长。根据细菌内毒素检查方法（鲎试剂，TAL）具有灵敏度高、快速、准确、操作简便等优点[2，3]，按《中国药典》“中药注射剂安全性检查法应用指导原则”及“细菌内毒素检查法”[4]，笔者建立了注射用肌萎灵细菌内毒素检查方法，以确保临床用药安全。

1 仪器与试药

XW-01定时可调速旋涡混匀器（上海医大仪器厂）；YJ-875B垂直净化工作台（上海阳光实验仪器有限公司）；DK-S26电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）。

注射用肌萎灵（本院自制，规格：每支820 mg，批号：jwl090203、jwl090301、jwl090302）；细菌内毒素工作标准品（CES，效价为每支10 EU，批号：090301）、TAL（灵敏度0.25 EU·mL-1，批号：080506）、细菌内毒素检查用水（WBET，规格：每支10 mL，批号：080301，内毒素含量＜0.015 EU·mL-1）均购于厦门市鲎试剂实验厂有限公司；TAL（灵敏度0.25 EU·mL-1，批号：08120912，福州新北生化工业有限公司；灵敏度0.25 EU·mL-1，批号：0902250，湛江博康海洋生物有限公司）。

2 方法与结果

2.1 内毒素限值（L）的确定

根据公式L＝K/M（式中K为按规定的给药途径，人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，注射剂K＝5 EU·kg-1·h-1；M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，人均按60 kg计算），根据使用说明书，本品成人日用量为2支（每支820 mg，溶解于250 mL注射用溶媒中），注射时间为2 h。因此，M＝（2×820）/（60×2）＝41/3≈13.7 mg·kg-1·h-1，则L＝5/13.7＝0.366 EU·mg-1。

2.2 TAL灵敏度复核试验

将CSE用WBET溶解后，于旋涡混合器上混合15 min，然后制成浓度为0.5、0.25、0.125、0.0626 EU·mL-1的稀释液，按照2010年版《中国药典》项下[4]试验进行（λ为TAL的标示灵敏度，为0.25 EU·mL-1），结果见表1。

表1 TAL灵敏度复核试验结果Tab 1 Verification results of the sensitivity of TAL

由表1可知，3个厂家的3批TAL经CSE检查，其灵敏度的测定值（λc）均位于0.5 λ～2 λ范围内，均符合规定，可用于细菌内毒素检查。

2.3 样品最小有效稀释浓度（c）的确定

根据最大有效稀释倍数公式MVD＝cL/λ。本品为注射用无菌粉末，MVD＝1，则c＝λ/L。本试验中L为 0.366 EU·mg-1。因此，本试验中c＝λ/L＝0.25/0.366＝0.68 mg·mL-1。

2.4 干扰预试验

将供试品初始溶液（820 mg/6 mL≈137 mg·mL-1，相当于c为0.68 mg·mL-1的约200倍），用WBET分别稀释2、40、80、120、160、200倍，使浓度约为67、3.3、1.7、1.1、0.8、0.7 mg·mL-1的溶液，每一个稀释倍数做2支供试品管（NPC）和2支供试品2λ浓度的CSE供试品阳性对照管（PPC）；另取2支CSE加WBET制成2λ的溶液作为阳性对照管（PC），2支TAL加WBET作为阴性对照管（NC）。按2010年版《中国药典》（一部）项下[4]进行试验，结果见表2。

表2 TAL的干扰预试验结果Tab 2 Results of the preliminary interference test of TAL

由表2可知，样品在上述试验稀释浓度对检测均无干扰，故选择供试品初始浓度稀释40倍，经干扰试验进一步验证。

2.5 干扰试验

用 WBET 将 3批供试品（jwl090203、jwl090301、jwl 090302）分别稀释为初始浓度的40倍，作为供试品溶液（A）；取供试品稀释液及WBET分别将CES稀释为0.5、0.25、0.125、0.062 5 EU·mL-1的溶液作为干扰试验溶液（B）和阳性对照溶液（C）；取WBET，作为阴性对照溶液（D）。照2010年版《中国药典》（一部）项下[4]方法，取3个厂家的TAL进行试验，结果见表3。

由表3可知，Es在0.5 λ～2.0 λ，且Et在0.5Es～2.0Es范围内，3个厂家的TAL试验结果基本一致，则供试品溶液在初始浓度稀释40倍时对细菌内毒素检测不产生干扰。

2.6 细菌内毒素检查

取3批样品用WBET稀释至初始浓度的40倍，作为供试品溶液；取3个厂家灵敏度为0.25 EU·mL-1的TAL，按照2010年版《中国药典》（一部）项下[4]进行试验。结果，3批样品经3个厂家TAL检测均符合规定。TAL检查结果见表4。

3 讨论

由于本品为注射用无菌粉末，溶解时本身会占用较大体积[5，6]，因此在试验过程中考虑到样品本身溶解后体积，结合质量标准检查项下试验，采用将样品先用6 mLWBET溶解，再进行稀释，避免了由于样品浓度不准确导致对细菌内毒素的宽松判定可能造成的临床使用不安全。

干扰预试验结果表明，试验考察的各稀释浓度均无干扰。由于中药注射剂成分较复杂，干扰因素较多，不同厂家不同批次的TAL亦存在一定差异，故在试验中选取相对较大的稀释倍数（40倍），以确保供试品浓度不对检测产生干扰。

表3 TAL的干扰试验结果Tab 3 Results of the interference test of TAL

表4 TAL检查结果Tab 4 Results of TALtest

经过3个不同厂家的TAL检测，3批制剂均符合规定，检测结果与家兔法结果一致，表明TAL进行细菌内毒素检查可用于注射用肌萎灵的质量控制。因其操作简单、灵敏快捷、准确可靠，可以大大提高检测效率，降低试验成本，值得在注射用肌萎灵批量生产检测过程中推广。

[1] 吴以岭.一种治疗肌肉萎缩及重症肌无力的药物及其制备方法[P].中国专利：200410096779.8，2007-12-12.

[2] 郑 霞，赵毓梅，刘 春.葛根素注射液细菌内毒素检查[J].中国药房，2007，18（16）：1 254.

[3] 陈德坚.枯痔注射液细菌内毒素检查法的建立[J].中国药房，2009，20（9）：699.

[4] 国家药典委员会编.中华人民共和国药典（一部）[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：附录131-132、附录88-89.

[5] 朱方美，高建平.对阿沙吉乐粉剂溶解后所占体积的分析[J].基层医学论坛，2007，11（1）：94.

[6] 罗素华，蒲 丽，邓小红.对需作过敏试验粉剂药物溶解后所占体积的研究[J].中国实用护理杂志，2005，21（10）：43.