丹参和川芎嗪联合应用对大鼠脑缺血再灌注氧化损伤的保护作用研究

张莉，高志军，赵静（.西藏大学医学院，拉萨市850000；.西藏当雄县人民医院，当雄县85500）

脑缺血再灌注损伤（Cerebral ischemia reperfusion injury，CIR）是指脑组织缺血一定时间恢复血供后，脑功能不但未能恢复，反而出现了更加严重的脑机能障碍。它是由兴奋性氨基酸中毒、氧化应激、细胞内钙超载、炎症反应和细胞凋亡等多种因素参与的病理过程[1]，其中自由基连锁反应被认为是造成脑组织损害的重要机制。因此，清除自由基、切断自由基对脑缺血的继发性损害已成为目前神经保护治疗的重要途径之一。近年研究表明，中药对CIR后的脑细胞起着重要的保护作用。丹参为唇形科多年生草本植物，以根入药，具有活血化瘀、宁心安神等功效。现代药理学研究表明[2～4]，丹参具有改善脑血流再灌注和脑血流自动调节机制，能清除自由基、抗生物膜过氧化、拮抗钙离子、防止钙超载。川芎嗪是川芎的一种生物碱，用于治疗闭塞性血管疾病、心绞痛、冠心病、脑血栓形成等[5～7]。本研究在已证实单味中药丹参、川芎嗪对CIR后对脑细胞有一定保护作用的基础上，进一步研究两药联合应用是否比单用的效果更好，以为临床用药提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

GGX25型原子吸收分光光度计（北京科创海光仪器有限公司）；721型分光光度计（南京第四分析仪器有限公司）。

1.2 试药

川穹嗪注射液（北京第四科宝制药有限公司，批号：100218；规格：40 mg·2 mL-1）；丹参注射液（上海中西制药有限公司，批号：091124，规格：3 g·2 mL-1）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 动物

健康Wistar成年大鼠200只，♂，体重（270±18）g，由第三军医大学实验动物中心提供（动物合格证号：24301050）。

2 方法

2.1 模型的复制

模型的复制方法参照文献[8]，采用大脑中动脉线栓法（MCAO）制备大鼠右侧大脑中动脉缺血2 h再灌注24 h模型。常规麻醉消毒，取颈旁右侧切口，分离右侧颈总动脉（CCA）、右颈外动脉（ECA）与颈内动脉（ICA），顺CCA经ICA将栓线送至颅内，遇阻力而止，栓线插入深度18～20 mm。缝合切口，留置线头于体外。脑缺血2 h再灌注时，将大鼠再次麻醉，轻轻抽提栓线至CCA内，使血流再通。假手术大鼠栓线只插入10 mm，其余步骤相同。复制模型成功的判定标准为大鼠清醒后出现右侧Homer征及以左前肢为重的偏瘫。

2.2 分组和给药

实验分为5组，即假手术（等渗盐水1.5 mL）、模型（等渗盐水1.5 mL）、丹参（2 g·kg-1）、川芎嗪（3.5 mg·kg-1）和丹参+川芎嗪（2 g·kg-1+3.5 mg·kg-1）组。分别于缺血后再灌注前20 min、再灌注后12、24 h大鼠尾静脉缓慢推注给药。

2.3 TTC染色测定各组大鼠脑梗死面积

大鼠于缺血2 h再灌24 h ig给药后迅速断头取左侧大脑，切去嗅球、小脑和低位脑干，间隔2 mm连续作6个脑冠状切片，立即置切块于37℃TTC染液（含3%TTC 4.0 mL，1 mol·L-1K2HPO40.1 mL）中避光恒温孵育30 min，在15 min时将脑组织块翻面，染色后用10%甲醛固定24 h。TTC被线粒体过氧化氢酶还原，可使正常组织染色呈红色，坏死组织呈白色。数码相机拍照，用形态学图像分析系统计算脑梗死区域占全脑总面积的百分比。公式如下：梗死面积百分比＝梗死面积/全脑总面积×100%。

2.4 脑组织水、钙含量的测定

同上取右前脑50～100 mg，称重后于105℃恒温箱烘干至恒重，即为干重。用公式[（湿重－干重）/湿重]×100%计算脑含水量。将烘干的脑组织次氯酸消化，5%盐酸定容，在原子吸收分光光度计上测吸光度（OD）值，以标准曲线法计算脑钙含量。

2.5 脑组织SOD活性、MDA含量测定

将大鼠断头取脑，用去离子水冲净表面，取视交叉和脚间窝间右脑扇形冠状切片约50～100 mg，通过分光光度计测定SOD活性和MDA含量。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 大鼠脑梗死面积的测定结果

与假手术组比较，模型组大鼠脑梗死面积显著增加（P＜0.01）；与模型组比较，各用药组大鼠脑梗死面积显著降低（P＜0.01），且丹参+川芎嗪组比单用药组效果更好，表明两药联合应用能明显减少CIR后大鼠的脑梗死面积。大鼠脑梗死面积的测定结果见表1。

表1 大鼠脑梗死面积的测定结果Tab 1 Results of cerebral ischemic area of rats

3.2 大鼠脑组织水、钙含量的测定结果

与假手术组比较，模型组大鼠脑组织中脑钙和脑水分含量显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各用药组大鼠脑钙和脑水分含量显著降低（P＜0.05），且丹参+川芎嗪组比单用药组效果更好，表明两药联合应用能明显减少CIR后大鼠的脑钙和脑水分含量。大鼠脑组织水、钙含量的测定结果见表2。

表2 大鼠脑组织水、钙含量的测定结果Tab 2 Results of the contents of brain wet and calcium in cerebral tissue of rats

3.3 大鼠脑组织MDA含量、SOD活性的测定结果

高（P＜0.01），而SOD活性显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，各用药组大鼠MDA含量显著降低（P＜0.05），SOD活性显著增强（P＜0.05），且丹参+川芎嗪组比单用药组效果更好。大鼠脑组织MDA含量、SOD活性的测定结果见表3。

表3 大鼠脑组织MDA含量、SOD活性的测定结果Tab 3 Results of the content of MDA and activities of SOD in cerebral tissue of rats

4 讨论

自由基广泛存在于生物体内，正常情况下自由基主要参与体内药物和毒物的降解，杀灭病原体，调节机体免疫功能。而体内存在许多抗氧化系统能清除自由基，使自由基的生成与清除处于动态平衡中，所以对机体并无有害影响。当大脑缺血再灌注时，氧自由基生成增多，其机制主要与Ca2+、线粒体、氧自由基和金属离子等有关。大量自由基的产生，使其生成与清除失衡，从而引起一系列自由基连锁反应，如过量氧自由基引起局灶性脑缺血再灌注后脑水肿和细胞凋亡等。Toyoda T等[9]已证实在脑缺血再灌注时，通过给予自由基清除剂可明显减轻脑水肿和缩小梗死体积。Troy CM等[10]发现，降低SOD水平可诱导细胞凋亡，提示氧自由基可能参与凋亡发生。Yoshiha S等[11]研究表明，在缺血性脑损伤中，自由基反应启动于缺血期，但明显过氧化反应却发生在再灌注期。鉴于自由基在缺血及再灌注损伤中的重要作用，抑制缺血再灌注时自由基的大量产生，减少自由基对机体组织的损害是保护脑组织的首要任务。

脑水肿包括血管源性脑水肿和细胞中毒性脑水肿，是缺血性脑损伤的并发症之一。脑组织含水量越多，表明脑缺血损害更严重。本研究表明，模型大鼠用药后能明显降低脑组织水分含量，减轻水肿，提示这两种药物对大脑组织具有保护作用。

SOD是酶促防御系统中一种重要的氧自由基清除剂，在脑缺血再灌注时，自由基的大量产生，使SOD大量消耗而活性降低，自由基产生和清除的动态平衡被打破，使细胞组织的结构和功能衰退。本研究表明，丹参和川芎嗪能提高缺血再灌注脑组织中SOD活性，显示丹参和川芎嗪能增强机体清除自由基的能力，减轻自由基的氧化性损伤，从而起到保护脑细胞的功能，且两药联合应用，效果更佳。

脑组织中富含脂质，易与自由基发生脂质过氧化反应而形成大量的脂质过氧化物（LPO），其中MDA是脂质过氧化反应的代谢产物，是许多不饱和脂肪酸的分解产物，MDA含量的升高间接地反映了O－含量的增加，进一步表明生物膜受自由基的损伤程度[12]。用药各组能够显著降低脑组织MDA含量，表明药物通过增强自由基清除能力和抑制自由基损伤而保护脑组织。

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