RP-HPLC 法测定小飞蓬总黄酮中野黄芩苷、槲皮素和木犀草素的含量Δ

叶豆丹，严铭铭，赵 爽，邵 帅，万志强，展 月（长春中医药大学，长春市 130117）

小飞蓬Erigeron canadensisL.为菊科飞蓬属的一年生草本植物，别名小白酒草、加拿大蓬、小蒸草、鱼胆草等，具有清热利湿、解毒消肿的功效，可治肠炎、痢疾、传染性肝炎、胆囊炎、疮疖肿毒、中耳炎、眼结膜炎[1]。本课题组已从该中药材中分离出黄酮类化合物近20种，生物碱类化合物近10种，其他类化合物20余种[2]。目前，本课题组对小飞蓬总黄酮进行了分离纯化，总黄酮含量已达76.52%，药效学实验表明其对小鼠肉瘤（S180）具有明显抑制作用。本试验针对其中所含有的3种成分——野黄芩苷、槲皮素和木犀草素，建立了相应的含量测定方法，确立了3种成分的含量，以为有效控制小飞蓬总黄酮的质量提供依据。

1 仪器与试药

Agilent1100高效液相色谱（HPLC）仪，包括Agilent化学工作站、DAD检测器、在线脱气机、四元高压梯度泵（美国Agilent公司）；KQ-250B超声清洗机（昆山市超声仪器有限公司）。

槲皮素（批号：100081-200406）、木犀草素（批号：111520-200504）与野黄芩苷（批号：110842-200504）对照品均购自中国药品生物制品检定所；小飞蓬采自吉林省长白县，经长春中医药大学姜大成教授鉴定为菊科飞蓬属植物小飞蓬E.canadensisL.；小飞蓬总黄酮（长春中医药大学研发中心自制，批号：090517，含量：76.52%）；甲醇为色谱纯，冰醋酸为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 混合对照品贮备液的制备

精密称取野黄芩苷、槲皮素、木犀草素对照品各6.5 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇超声（功率：250 W，频率：40 kHz）溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度均为0.65 mg·mL-1的野黄芩苷、槲皮素与木犀草素混合对照品贮备液。

2.2 供试品溶液的制备

取小飞蓬总黄酮50 mg，加甲醇20 mL，超声（功率：250 W，频率：40 kHz）溶解并定容至25 mL，经0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.3 色谱条件

色谱柱：ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-0.5%冰醋酸水溶液（B），梯度洗脱（0～12.00 min，A∶B＝40 ∶60；12.01～30.00 min，A∶B＝62 ∶38；30.01～50.00 min，A∶B＝85∶15）；检测波长：360 nm；流速：1 mL·min-1；柱温：30℃[3，4]。分别精密吸取混合对照品贮备液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图。色谱见图1。

2.4 线性关系考察

精密吸取上述混合对照品贮备液0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成含野黄芩苷、木犀草素与槲皮素分别均为0.052、0.065、0.078、0.091、0.104、0.117 mg·mL-1的混合对照品溶液，分别吸取10 μL注入液相色谱仪，照上述色谱条件测定峰面积。以峰面积积分值（Y）为纵坐标，对照品进样量（X）为横坐标，制备标准曲线，得槲皮素的回归方程为Y＝1 081X+16.062（r＝0.999 9，n＝6）；野黄芩苷的回归方程为Y＝68.361X－396.85（r＝0.999 9，n＝6）；木犀草素的回归方程为Y＝68.999X－276.54（r＝0.999 9，n＝6）。结果表明，3种成分的进样量均在0.52～1.17 μg范围内与各自峰面积积分值呈良好的线性关系。

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

2.5 精密度试验

精密吸取上述混合对照品贮备液10 μL，重复进样5次，测定峰面积。结果，野黄芩苷、槲皮素、木犀草素的RSD分别为1.10%、1.94%、1.47%（n＝5），表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验

精密称取同一小飞蓬总黄酮样品6份，每份50.0 mg，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液，各吸取10 μL注入液相色谱仪，测定峰面积。结果，野黄芩苷、槲皮素、木犀草素的RSD分别为1.56%、1.36%、1.04%（n＝6），表明方法重复性良好。

2.7 稳定性试验

于0、1、4、8、12、24 h分别精密吸取室温放置的同一供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积。结果，野黄芩苷、槲皮素、木犀草素的RSD分别为1.18%、1.29%、1.16%（n＝6），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.8 加样回收率试验

精密称取已知含量的样品6份，每份约20.0 mg（野黄芩苷、槲皮素、木犀草素含量分别为3.127%、7.707%、6.718%），分别精密加入野黄芩苷、槲皮素与木犀草素对照品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，依含量测定方法操作，进样测定，计算加样回收率，结果分别见表1～表3。

表1 野黄芩苷的加样回收率试验结果（n＝6）Tab 1Results of recovery tests of scutellarin（n＝6）

表2 槲皮素的加样回收率试验结果（n＝6）Tab 2Results of recovery tests of querceti（nn＝6）

表3 木犀草素的加样回收率试验结果（n＝6）Tab 3Results of recovery tests of luteolin（n＝6）

2.9 样品含量测定

分别精密称取5批小飞蓬总黄酮样品适量，照“2.2”项下方法分别制备供试品溶液，取10 μL注入液相色谱仪，依法各测定3次，计算样品中野黄芩苷、槲皮素和木犀草素的含量，结果见表4。

表4 样品含量测定结果（%，n＝3）Tab 4Results of content determination of sample（s%，n＝3）

3 讨论

笔者曾分别测定槲皮素、木犀草素、野黄芩苷对照品与样品的最大紫外吸收波长，结果发现槲皮素与木犀草素对照品分别为368 nm与349 nm，而野黄芩苷对照品在285 nm及337 nm波长处各有一最大吸收峰，但样品在360 nm波长附近有一较强吸收峰，故将检测波长设在360 nm波长处。

采用梯度洗脱方式，以甲醇-0.5%冰醋酸水溶液为流动相，节省了流动相，并大大缩短了测试时间，取得了较为满意的结果。

综上，本试验所建反相HPLC法简便、快速、准确，可为有效控制小飞蓬总黄酮的质量提供依据。

[1] 张 丽，李彩芳，李晓梅，等.加拿大蓬α-葡萄糖苷酶抑制作用[J].河南大学学报（医学版），2008，27（4）：39.

[2] 邵 帅，严铭铭，毕胜男，等.小飞蓬化学成分的研究[J].中国药学杂志，2009，44（14）：1 053.

[3] 张 洁，顾政一，何承辉，等.HPLC法同时测定新疆一枝蒿中木犀草素和一枝蒿酮酸的含量[J].中国实验方剂学杂志，2009，15（4）：1.

[4] 龙风荣，孙 敏.HPLC测定热淋清胶囊中槲皮素的含量[J].中成药，2007，29（4）：613.