2型糖尿病患者泪液与血浆中同型半胱氨酸水平与其眼表损害的相关性研究

张日佳， 陈 剑△， 宋子宣， 王彦平

(暨南大学1附属第一医院眼科，2医学院病理生理学系，广东 广州 510632)

糖尿病性眼表损害是糖尿病最为常见的并发症之一，但其病变机制至今仍不十分清楚。近年来，有关糖尿病氧化应激学说的报道越来越多［1－3］，糖尿病时活性氧蓄积和氧自由基反应明显增强，不但引起视网膜病变，也是眼表病变发生的可能机制之一。

同型半胱氨酸又称高半胱氨酸(homocysteine，Hcy)，在金属离子的存在下直接或间接氧化产生、H2O2、OH·等氧自由基，起氧化应激反应，导致血管内皮细胞和内质网的直接损害。Hcy还能激活炎症反应的重要调节因子核因子κB(nuclear factor kappa B，NF－κB)，通过NF－κB通路进行调控，刺激白细胞介素6(interleukin－6，IL－6)的表达，参与炎症反应。目前人们主要应用高效液相色谱分析法来测定血浆中的游离Hcy和总Hcy水平，对于机体其它组织或体液中的Hcy水平未见有研究报道。分析Hcy水平与糖尿病性眼表损害及糖尿病性视网膜病变之间的相互联系，旨在进一步探索糖尿病造成的眼表组织损害的可能机制，为防治糖尿病性眼部并发症提供新的理论依据。

材料和方法

1 材料

1.1 主要仪器和试剂 惠普公司Angilen 100系列高效液相色谱仪+荧光检测器及ODS Hypersil色谱分离柱;标准品 Hcy、内标胱胺、TCEP［tris(2－carboxyethyl)phosphine］购自Sigma，荧光衍生剂SBDF(7－fluorobenzo－2－oxa－1，3－diazole－4－sulphate)购于Fluka，三氯乙酸购自天津市科密欧化学试剂开发中心，其余试剂为国产分析纯或光谱纯。

1.2 病人资料 我院内分泌科住院的2型糖尿病患者(均符合1980年WHO糖尿病诊断标准)40例为病例组，共80眼，其中男21例，女19例;年龄45～75岁，平均(58.68±7.33)岁。于我院眼科选取体检的正常健康人(性别、年龄匹配)40例为对照组，80眼，其中男21例，女19例，年龄47～74岁，平均(59.15±7.20)岁。

2 方法

2.1 收集血浆样品 所有实验对象均采清晨空腹静脉血3 mL，2%EDTA抗凝，30 min内离心分离出血浆(2500×g离心10 min)，－20℃保存。

2.2 收集泪液样品 实验对象取平卧位，采血的同时用细棉签刺激中鼻甲附近黏膜引起反射性泪液分泌，在内眦部泪阜处汲取泪液，共取200 μL。

2.3 应用高效液相色谱结合荧光检测分析法来测定血浆及泪液中的 Hcy水平 Pfeiffer等［4］报道了14个不同国家、地区的实验室(共8种不同的测定方法)协作测定相同血浆样品Hcy，结果表明，用“TCEP+SDB－F”组合的高效液相色谱结合荧光检测分析法批间变异最小。高效液相色谱结合荧光检测分析法的两个关键步骤是Hcy的还原以及荧光衍生。TCEP是一种新的性质稳定、使用方便的Hcy还原剂;SDB－F是巯基特异性荧光衍生剂，用其对测试样品中的Hcy、谷胱甘肽等含巯基化合物进行柱前衍生;“TCEP+SDB－F”组合使得本实验具有更高的敏感性和特异性［5］，且无干扰峰。胱胺为含巯基化合物，不存在于血浆及泪液，不与血浆中其它物质发生明显化学反应，荧光衍生效果良好，是一个合适的内标，以其参与反应体系，可与所要检测的物质(Hcy)产生随同变化，减少实验误差及变异。测定时设置全空白对照品、单品Hcy对照及单品胱胺对照，可明确Hcy及内标胱胺所在的光谱峰。

制备80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078125μmol/L Hcy标准品工作液。然后进行样品处理，取50 μL待测品(血浆、Hcy标准品)，与 25 μL 10 μmol/L 胱胺溶液、25 μL PBS(pH 7.4)混合，加入 100 g/L TCEP 10 μL，室温下作用30min。加入含1 mmol/L EDTA的100g/L三氯乙酸90 μL，13000 ×g 离心 10 min。取上清液 50 μL，加至含以下混合物的自动进样器小管中:1.55 mol/L NaOH 10 μL，0.125 mol/L 硼 酸 盐 缓 冲 液 (含4 mmol/L EDTA，pH 9.5)125 μL，1.0 g/L SDB － F(硼酸盐缓冲液中)50 μL。60℃温育60 min后上机(惠普公司Angilen 100系列高效液相色谱仪+荧光检测器 )进行测试，每次进样量为20 μL。色谱条件设定为，流动相:25 mmol/L KH2PO4(pH 2.5)∶甲醇=95∶5;流速:0.5 mL/min;色谱柱:Hypersil ODS C18(250 mm ×4 mm，5 μm 填充颗粒);柱温:40 ℃;荧光检测波长:激发波长为385 nm，发射波长为515 nm。取 0.625、0.3125、0.15625 μmol/L Hcy 标准品经样品处理后分别上样做最低检测限测试;取1.25～80 μmol/L Hcy标准品制备标准曲线。以Hcy与内标胱胺的色谱峰面积比对Hcy的浓度作线性回归分析，结果表明Hcy浓度在0.078125～40.0 μmol/L范围内有良好的线性关系，相关系数r2=0.9996。经方差分析(ANOVA)，回归的均方=12.646，F=10391.481，P＜0.01，因此认为Hcy浓度与Hcy与内标胱胺的色谱峰面积比之间有良好的直线关系。直线回归方程为Y=0.09199X－0.011，回归系数t检验t=101.939，P＜0.01(与方差分析一致)，因此认为回归系数有显著意义。标准曲线内包含0.078125～40.0 μmol/L 10个浓度点。根据所得标准曲线测得样品中Hcy含量。

2.4 分别对两组研究对象依次进行角膜敏感度测定、Schirmer I试验、泪膜破裂时间(breaking up time，BUT)侧定、角膜荧光素染色及结膜虎红染色。

2.5 以眼底荧光血管造影确诊糖尿病性视网膜病变的分期。

3 统计学处理

结 果

1 临床资料

2型糖尿病患者组与健康对照组年龄差异无显著(P＞0.05)，且两组中不同性别的年龄差异亦无显著(病例组P＞0.05;对照组P＞0.05)。糖尿病视网膜病变根据眼底荧光血管造影的结果按照糖尿病视网膜病变国际分期标准进行诊断和分期，病例组40例患者中I期16只眼，II期15只眼，III期13只眼，IV期12只眼，V期24只眼。

2 高效液相色谱分析法所得色谱分离曲线

通过对照单胱胺(cystamine)、单 Hcy及内标cystamine的Hcy标准品的色谱分离曲线可得出cystamine的保留时间为8.496 min，Hcy的保留时间为8.064 min，因此在色谱分离曲线上可见保留时间8 min后先后出现的2个波峰分别为Hcy和cystamine，见图1。

Figure 1.Chromatograph separation curves of Hcy.A:plasma Hcy of diabetic patients;B:plasma Hcy of control;C:tear Hcy of diabetic patients;D:tear Hcy of control;LU:luminance unit.图1 Hcy色谱分离曲线

3 2型糖尿病患者组与对照组泪液与血浆Hcy含量

2型糖尿病患者组泪液Hcy为(0.327±0.107)μmol/L，对照组泪液 Hcy为(0.224±0.020)μmol/L，两组间差异显著P＜0.01。2型糖尿病患者组血浆Hcy为(18.750±7.858)μmol/L，对照组Hcy为(8.446±2.793)μmol/L(检测结果符合文献报道的健康人群 Hcy的正常值范围［6］)，两组间差异显著，P ＜0.01。

4 对照组泪液与血浆Hcy含量的相关性分析

经Pearson相关分析，对照组泪液与血浆Hcy含量之间的Pearson相关系数r=0.675，P＜0.01，显示正常人泪液Hcy含量与血浆Hcy含量间呈正相关。

5 2型糖尿病患者组泪液、血浆Hcy含量与糖尿病视网膜病变程度间的相关性分析

经偏相关分析，2型糖尿病患者组泪液与血浆Hcy含量之间的 Pearson相关系数 r=0.911，P＜0.01;血浆Hcy含量与糖尿病视网膜病变程度间的Pearson相关系数r=0.548，P＜0.01;泪液Hcy含量与糖尿病视网膜病变程度间的Pearson相关系数r=0.630，P＜0.01。当糖尿病视网膜病变程度控制时，泪液与血浆Hcy含量之间呈正相关，Pearson相关系数 r=0.871，P ＜0.01。

6 泪液、血浆Hcy含量与年龄的相关性分析

不论是2型糖尿病患者还是正常人的泪液及血浆中Hcy的含量均与其年龄无相关性，见表1。

表1 两组泪液、血浆Hcy含量与年龄的相关性分析Table 1.Pearson correlation analysis between age and Hcy concentration in the two groups

7 角膜敏感度检查结果

糖尿病患者的角膜上5个不同部位的敏感度均较正常对照组显著降低。两组的角膜敏感度均为中央部最敏感，下方角膜敏感度最差。而糖尿病组的角膜敏感度在角膜的不同部位均较对照组降低，且降低的幅度以颞、鼻、上、下侧四周较中央部更显著。

8 2型糖尿病患者组泪液Hcy含量与角膜敏感度之间的关系

角膜知觉计测量值的单位为mg/mm2，表示该部位的角膜感觉神经感受到外界刺激时每mm2所需的质量，该数值越大说明角膜敏感度越低，两者呈反比例关系。Spearman等级相关分析结果显示，2型糖尿病患者泪液Hcy含量与角膜知觉计测量值的相关系数为:0.512(角膜中心区)、0.648(颞侧角膜)、0.524(鼻侧角膜)、0.632(上方角膜)和 0.634(下方角膜)，相关具有统计学意义(均P＜0.01)。此结果提示，泪液Hcy含量与角膜敏感度呈负相关关系，即泪液中Hcy含量越高，其角膜敏感度越低。

9 Schirmer I试验与BUT检查

2型糖尿病患者组Schirmer I试验值较对照组显著减低，且随糖尿病视网膜病变程度的加重，Schirmer I试验值下降程度越明显。糖尿病组的泪膜破裂时间亦较对照组显著缩短，且随糖尿病视网膜病变程度的加重，BUT值呈下降趋势，两者间呈负相关。

10 角膜荧光素染色及结膜虎红染色检查结果

2型糖尿病患者组角膜荧光素染色及结膜虎红染色的阳性率及染色程度均较对照组显著增高，且随糖尿病视网膜病变程度的加重，患者角膜荧光素染色及虎红染色程度总体呈升高趋势，两者间呈正相关。

讨 论

Hcy是与半胱氨酸同系的四碳含硫氨基酸，在细胞内由蛋氨酸代谢脱去甲基后形成，是蛋氨酸代谢的中间产物，胰岛素对Hcy代谢具有重要的调节作用。大量的研究和文献报道Hcy是心脑及外周血管病变的独立危险因子，并且Hcy水平与糖尿病有关［7，8］，有研究表明血中 Hcy水平的增高可诱导血管内皮功能障碍，继而促进微循环障碍及微血栓形成［9］，而研究者从体外实验中发现，由于叶酸缺乏而导致的半胱氨酸的水平增高可诱发神经干细胞死亡［10］，且孕妇在怀孕期间维生素B12缺乏可致胎儿血中同型半胱氨酸水平升高并增加神经系统发育缺陷发生率［11］，由此得到提示，Hcy的升高与糖尿病外周神经的损害存在一定相关性。糖尿病性视网膜病变是是临床最为常见和严重的糖尿病眼部并发症之一，随着人们对生活质量要求的不断提高，糖尿病性眼表损害在近年来逐渐引起人们的重视。多年来大量的研究其中也包括我们之前的研究［12－17］证明，糖尿病眼表损害主要表现为角膜敏感度下降、泪液质量异常、泪液分泌减少、结膜鳞状化生、杯状细胞减少甚至缺失。但糖尿病眼表损害的机制至今仍不十分清楚。Dogru等［15］认为糖尿病患者的眼表改变与血糖的控制情况及周围神经病变有关。Inoue等［14］认为糖尿病角膜上皮病变是糖尿病多发性神经病变和高糖状态下角膜上皮和基底膜代谢异常的结果。

既往对Hcy与糖尿病之间的研究均采集患者的血液样品，本研究除了检测2型糖尿病患者组和对照组血浆中的Hcy水平，还首次检测了泪液中的Hcy水平，结果显示糖尿病组血浆、泪液中的Hcy水平均较对照组升高，并且血浆Hcy和泪液Hcy水平存在正相关，且随着糖尿病视网膜病变程度的加深呈升高趋势。2型糖尿病患者出现角膜敏感度下降、泪液分泌减少、泪膜不稳定等眼表改变，和之前的研究结果相一致［12－16］。而本研究结果显示糖尿病患者周边的角膜敏感度下降程度较中央部更显著，这与眼表泪液更多分布、接触周边角膜的生理特点相符，这提示我们泪液中的Hcy含量升高很可能直接参与了糖尿病眼表病变过程。根据Hcy的特性，我们推测糖尿病眼表损害的机制可能为:角膜结膜上皮和结膜杯状细胞由于泪液中Hcy氧化应激损伤而凋亡，造成眼表损害;泪腺毛细血管由于血浆中的Hcy水平的升高，使血管壁内皮细胞和内质网的直接损害，造成内皮细胞脱落，使泪腺血液供给减少，泪液的分泌减少，从而造成泪腺分泌功能障碍;泪液中Hcy水平的增高直接损伤角膜三叉神经;由于角膜上皮细胞的营养主要来自泪液，泪液中Hcy升高，使上皮细胞的代谢受到影响，并且使其受到氧化损伤，致使细胞死亡，造成眼表损伤;泪液Hcy升高也可能促使眼表的炎症因子产生，参与眼表炎症。综上所述，泪液中的Hcy增高可能是造成糖尿病眼表损害的其中一个因素，而其具体作用机制还有待进一步实验研究进行论证。对2型糖尿病患者泪液中Hcy水平的检测是否能成为监控糖尿病眼表病变的一项指标，以及对血浆和泪液中的高Hcy进行干预性治疗，如叶酸及维生素B12干预能否减轻糖尿病的眼部并发症损害均需进一步研究。

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