雷帕霉素增强子宫内膜癌细胞对阿霉素的敏感性*

许成芳， 李小毛， 李 田， 王小韵

(中山大学附属第三医院妇科，广东 广州 510630)

子宫内膜癌是原发于子宫内膜的一种上皮性恶性肿瘤，是女性生殖道最常见的恶性肿瘤之一。近年来，子宫内膜癌的发病率在世界范围内有所上升，但5年生存率却逐年下降。目前，化疗已经成为有小残余病灶的晚期患者和高危早期患者的一线治疗方案［1］。

阿霉素(adriamycin，ADM)是传统的子宫内膜癌一线化疗药物，其抗肿瘤机制主要是嵌入RNA或DNA中而抑制核酸合成，导致细胞凋亡［2］。阿霉素在临床上的应用日益广泛，但是阿霉素在治疗剂量时产生非特异性的毒副作用，病人往往很难耐受，大大限制了阿霉素在临床上的应用。因此，减少阿霉素的临床用量，降低毒副作用已成为成为阿霉素应用的关键。大量研究表明特异性抑制PI3K(phosphatidylinositol－3－kinase)/Akt(protein kinase B)通路的活性可减少肿瘤细胞的化疗耐药性，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是哺乳动物 PI3K/Akt通路的下游效应物，它通过PI3K/Akt的磷酸化而被活化的，从而调节细胞的增殖凋亡等［3］。以抑制mTOR为主要作用原理的雷帕霉素成为新的抗肿瘤药物，并进入临床开发的早期阶段［4］。本研究拟将mTOR的抑制剂雷帕霉素(rapamycin，RA)与阿霉素联合使用，观察雷帕霉素是否增强阿霉素在子宫内膜癌细胞中敏感性，并探讨相关分子机制。

材料和方法

1 材料

1.1 细胞株 人子宫内膜癌细胞株Ishikawa［PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)阴性］细胞及HEC－1A细胞(PTEN阳性)由中山三院中心实验室保存。

1.2 试剂 胎牛血清购自Gibco;DMEM购自Hyclone;兔抗 p－Akt和caspase－3单抗购自Cell Signaling Technology;鼠抗人PTEN购自Santa Cruz Biotechnology;鼠抗β－actin多克隆抗体购自Sigma;细胞总蛋白提取试剂盒购自Pierce;蛋白分子量marker购自Fermentas;Annexin V－FITC凋亡试剂盒购自北京宝赛生物技术有限公司;rapamycin购自Cell Signaling Technology;阿霉素购自Sigma。

2 方法

2.1 细胞培养 Ishikawa及HEC－1A于含10%胎牛血清的DMEM培养液中培养，培养条件在5%CO2、37℃及饱和湿度下进行。

2.2 细胞处理与分组 将rapamycin溶解在DMSO中，配成100 mmol/L的液体，于实验当天用DMEM培养液稀释，使DMSO的浓度在0.1%以下。并用培养基稀释阿霉素。rapamycin稀释后的浓度为10 nmol/L，阿霉素浓度为1 μmol/L。实验分为4组:对照组(培养液+细胞)、rapamycin组、阿霉素组、rapamycin+阿霉素组。联合用药组为rapamycin作用24 h后再加阿霉素继续作用24 h。

2.3 MTT检测子宫内膜癌细胞的增殖情况及计算IC50值 以1×104cells/well接种于96孔板中，常规培养24 h，待细胞贴壁后，在细胞处于对数生长期时弃原培养基，加入4组干预药物工作液。4组细胞处理24、48、72 h(每组设 3个复孔 )后，每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μL继续孵育4 h，每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min，用酶联免疫检测仪读取每孔的吸光度(absorbance，A)值。按下式计算细胞存活率(%)=A试验组/A对照组×100%;细胞抑制率(%)=(1－A试验组/A对照组)×100%。绘制细胞增殖曲线。

2.4 采用金正均法计算联合指数(combination index，CI)判断两药合用是否具有协同作用 公式:CI=Ea+b/(Ea+Eb－ Ea×Eb)，公式中Ea+b为联合处理组的抑制率，Ea、Eb分别为a药和b药单独处理的抑制率。若q值在0.85～1.15间为两药合用单纯相加，若q＞1.15为有协同作用，若q＜0.85表示两药合用有拮抗作用。

2.5 流式细胞术检测细胞凋亡情况 各组细胞加药干预24 h后收集细胞，检测细胞凋亡，培养基+细胞组作为空白对照。200 μL binding buffer重悬细胞，加入 10 μL Annexin V 和 4 μL PI(propidium iodide)，室温中避光孵育30 min，最后加入300 μL binding buffer，1 h内流式细胞仪检测，Cell Quest软件计算细胞凋亡率。每组实验重复3次。

2.6 Western blotting检测 提取细胞蛋白，BCA法定量，取等量样本上样于10%SDS－PAGE进行电泳分离，并电转移至硝酸纤维素膜上，室温封闭1 h，Ⅰ抗4℃孵育过夜，Ⅱ抗室温孵育1 h，加入ECL化学发光试剂检测。结果采用图形分析软件Quantity One对条带进行灰度扫描分析。

3 统计学处理

数据采用SPSS 11.5软件进行非参数检验和方差分析。计量资料以均数±标准差()表示。

结 果

1 阿霉素、雷帕霉素单独及合用对子宫内膜癌细胞增殖的影响

结果表明，阿霉素、雷帕霉素单独使用对Ishikawa细胞和HEC－1A细胞的增殖均有明显的抑制作用。抑制率与时间、剂量呈正相关。其中，雷帕霉素在Ishikawa细胞作用 48h的 IC50为(32.4±4.2)nmol/L，在 HEC －1A 细胞的 IC50为(179.7 ±22.8)nmol/L。阿霉素在Ishikawa细胞作用24 h的IC50为(21.3±3.8)μmol/L，而在 HEC －1A 细胞的 IC50为(14.3 ±2.8)μmol/L，见图1。

Figure 1.The effects of rapamycin(RA)or/and adriamycin(ADM)on proliferation in HEC－1A cells(A)and Ishikawa cells(B)..n=3.图1 雷帕霉素或/和阿霉素对子宫内膜癌细胞增殖影响

根据我们前期实验数据，先用雷帕霉素10 nmol/L预处理24 h，然后用阿霉素处理Ishikawa细胞和HEC－1A细胞。结果显示，与单用阿霉素组相比，两药合用组阿霉素24 h的 IC50分别降至(11.9±1.2)μmol/L(Ishikawa细胞)和(8.2±0.9)μmol/L(HEC－1A细胞)，差异显著(P＜0.05)。阿霉素与雷帕霉素的联合指数在Ishikawa细胞为1.85，而 HEC －1A 细胞为 1.47，均大于 1.15，提示阿霉素与雷帕霉素合用在子宫内膜癌细胞中有协同作用。

2 阿霉素、雷帕霉素单独或合用对子宫内膜癌细胞凋亡率的影响

结果显示，与对照组比较，阿霉素、雷帕霉素单独使用时均能明显诱导子宫内膜癌细胞的凋亡。雷帕霉素10 nmol/L预处理24 h后，阿霉素5 μmol/L作用24 h，HEC－1A细胞的凋亡率为(58.93±5.76)%，Ishikawa细胞的凋亡率为(48.61±4.35)%，较药物单用组均有明显升高，提示阿霉素与雷帕霉素合用能协同诱导细胞凋亡，见图2。

3 阿霉素、雷帕霉素单独或合用对caspase－3和PI3K/Akt磷酸化作用的影响

结果显示，雷帕霉素10 nmol/L作用于HEC－1A及Ishikawa细胞48 h后，与对照组相比，p－Akt及活化的caspase－3蛋白的表达显著增强，pmTOR蛋白的表达明显减弱。阿霉素5 μmol/L作用于细胞24 h后，2株细胞中p－mTOR蛋白的表达均有不同程度的减弱，活化的caspase－3蛋白表达增强，其中HEC－1A细胞的变化更明显。以上结果提示阿霉素对PI3K/Akt通路有抑制的作用，见图3。

雷帕霉素10 nmol/L预处理24 h后，阿霉素5 μmol/L浓度再作用24 h，与单药组相比较，2株细胞的p－Akt和p－mTOR蛋白的表达均有进一步的下降，活化的caspase－3表达则显著增强，差异显著(P＜0.05)，在 HEC－1A细胞中这种变化更加明显。

Figure 2.The effects of RA or/and ADM on apoptosis of endometrial cancer cells.BC:blank control;RA:rapamycin treatment;ADM:adriamycin treatment;RA+ADM:rapamycin in combination with adriamycin treatment..n=3.*P＜0.05 vs RA or ADM.图2 雷帕霉素或/和阿霉素诱导子宫内膜癌细胞凋亡

讨 论

近年来，国外开展了多项针对早期高危子宫内膜癌术后辅助化疗的随机对照研究表明，化疗对预防早期子宫内膜癌复发，治疗晚期小残余病灶具有良好的作用［5］。阿霉素是目前常用的治疗子宫内膜癌的药物。作为细胞毒性药物，其抗肿瘤作用主要是通过引起不可修复的DNA破坏最终导致细胞凋亡的产生，然而，作为子宫内膜癌的一线化疗药物，该药严重的毒副作用，以及肿瘤细胞对其产生的耐药性都是导致肿瘤化疗失败的重要因素。因此，寻找减少耐药、增强阿霉素疗效的方法具有重要的临床意义［6，7］。

Figure 3.The effects of RA or/and ADM on the expression of p－Akt，caspase－3 and p－mTOR in HEC－1A cells(A)and Ishikawa cells(B).BC:blank control;RA:rapamycin treatment;ADM:adriamycin treatment;RA+ADM:rapamycin in combination with adriamycin treatment..n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs RA or ADM.图3 雷帕霉素或/和阿霉素对子宫内膜癌细胞p－Akt、caspase－3和p－mTOR蛋白表达的影响

最近的研究显示，分子靶向药物与细胞毒性药物联合使用能够降低药物的使用剂量，增加抗肿瘤药物的细胞毒性从而降低肿瘤细胞对药物的耐药性，提高化疗药物的疗效［8－11］。雷帕霉素是大环内酯类的抗生素，也是最早被发现的mTOR抑制剂，主要通过阻断肿瘤细胞的能量来源和有丝分裂过程达到抗肿瘤作用［12］。本研究结果证实，体外应用雷帕霉素作用于子宫内膜癌细胞株HEC－1A和Ishikawa可起到抑制增殖及诱导凋亡的作用。同时，我们研究还发现，雷帕霉素与阿霉素联合使用抑制子宫内膜癌细胞的增殖效果较两药单独使用好，这种抑制作用表现为良好的时间和剂量依赖性，协同作用明显。更重要的是，两药合用后，阿霉素的IC50明显降低，细胞凋亡率显著升高，提示雷帕霉素能增加阿霉素的细胞毒性，从而降低阿霉素的起效剂量。作为联合用药，其剂量与用药顺序都很重要。本研究显示提前24 h使用1/2～1/10的IC50剂量的抑制剂再加用1/4的IC50剂量的阿霉素，就能达到细胞抑制50%的效果。以上结果提示雷帕霉素能够增强阿霉素抑制肿瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡的作用，在不影响药物疗效的前提下，可以减少阿霉素的临床用量，减少阿霉素耐药性的产生，这为开辟新的子宫内膜癌临床化疗方案提供了思路。

PI3K/Akt/mTOR信号转导通路不仅与细胞的增殖、凋亡有关，而且在肿瘤的生长、对化疗的反应方面都扮演着重要角色［13］。特异性抑制 PI3K/Akt/mTOR通路的活性可减少肿瘤细胞的化疗耐药性，可增强化疗效果，因此，PI3K/Akt/mTOR通路可作为肿瘤治疗的潜在靶点［14，15］。我们的研究发现，阿霉素可以明显抑制p－Akt的蛋白表达，而雷帕霉素可以显著降低mTOR的蛋白水平，两者合用后整个PI3K/Akt/mTOR通路的蛋白表达都下调，凋亡蛋白活化的caspase－3表达明显增强。阿霉素与雷帕霉素分别作用于信号通路的不同环节，充分抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路，可能是两药合用产生协同作用的机制。

综上所述，雷帕霉素与阿霉素联合使用能够降低阿霉素在子宫内膜癌细胞中的使用剂量，协同增加子宫内膜癌细胞对阿霉素的敏感性从而降低肿瘤细胞对药物的耐药性，为提高阿霉素在临床的疗效提供了一个很好方案。

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