Prohibitin在低胆固醇培养人前列腺癌细胞系PC－3中表达上调及其可能机制*

董 培， 李永红， 尧 凯， 刘卓炜， 周芳坚

(华南肿瘤学国家重点实验室，中山大学肿瘤防治中心泌尿外科，广东 广州 510060)

高脂肪/胆固醇等“西方饮食”同前列腺癌的发病和进展密切相关［1］。高血清胆固醇水平能够促进前列腺癌的发展。然而，循证医学证据表明，采用胆固醇合成抑制药物如羟甲基戊二酰辅酶A(hydroxymethylglutaryl coenzyme A，HMG－CoA)还原酶抑制剂并不能降低前列腺癌整体风险率［2］，具体机制尚未明确。我们研究发现，低胆固醇培养前列腺癌PC－3细胞中prohibitin(PHB)表达升高。本实验通过构建PHB基因启动子调控的真核表达载体，转染前列腺癌PC－3细胞，分析其转染活性并进一步验证其胆固醇敏感活性，为进一步研究其在胆固醇影响前列腺癌进展的基因研究提供基础。

材料和方法

1 材料

萤光素酶报告基因载体pGL3－Basic为Pro-mega产品，前列腺癌细胞系PC－3细胞为中山大学肿瘤防治中心实验室保存。DNA聚合酶、Xho I、Hind III和T4 DNA连接酶为New England Biolabs产品;脂质Lipofectamine 2000为Invitrogen产品;质粒纯化试剂盒及胶回收试剂盒为Qiagen产品，Luciferase Assay System为Promega产品。

2 方法

2.1 细胞培养及分组 实验分为对照组和实验组，对照组PC－3细胞株传代培养于100 mm细胞培养皿中，加入10 mL DMEM+10%FBS培养液置于37℃、5%CO2培养24 h。实验组弃去培养液，加入12 mL DMEM+10%脂蛋白缺乏血清(lipoproteindeficient fetal bovine serum，LPDS)+50 μmol/L甲羟戊酸盐(mevalonate)和50 μmol/L司伐他汀(simvastatin)培养液。继续放入37℃、5%CO2培养箱培养48 h。

2.2 Real－time PCR定量检测 PHB mRNA 培养48 h后，Trizol一步法提取总RNA后，按说明书操作反转录成cDNA。根据GenBank中人PHB基因序列号(NM_002634)的mRNA序列，根据引物设计原则，运用Oligo 6引物设计软件设计。选定核苷酸号为131－305的序列，上游引物5'－GGAGGCGTGGTGAACTCTG －3'，下游引物 5'－ CTGGCACATTACGTGGTCG A G－3'，扩增片段长度为175 bp。以GAPDH为内参照引物，上游引物 5'－TGAACGGGAAGCTCACTGG －3'，下游引物 5'－TCCACCACCCTGTTGCTGTA－3'，扩增片段长度为317 bp。反应体系加入SYBR® Green PCR Master Mix，按照试剂盒要求配置。混合样品均匀加入至ABI MicroAmp光学96孔反应板中，盖上盖子密封，离心、去除气泡。每份样本重复3次以减小加样误差。在ABI PRISM 7900HT扩增仪上设置95℃预变性5 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循环35次，4 ℃终止反应。基因表达结果分析运用2－ΔΔCt法分析。

2.3 PHB基因启动子引物的设计和合成 根据GenBank中人 PHB promoter(GenBank accession#DQ406856)的mRNA序列，运用人17染色体基因DNA为模板参照文献设计:正向引物 5'－GCAACTCGAGGGAGAAACCCCGTCTCTAC－3'(下划线核苷酸部分为Xho I内切酶位点)，前面采取4个碱基进行硫代修饰，反向引物 5'－GCAAAAGCTTCCTCACAAGTCGGACTCACGC －3'(下划线核苷酸部分为Hind III内切酶位点)，前面采取4个碱基进行硫代修饰。同时选择低密度脂蛋白受体(low－density lipoprotein receptor，LDLR)为阳性对照，根据GenBank中LDLR promoter(GenBank accession#L29401)的碱基序列，以人总染色体DNA为模板参照文献设计:正向引物5'－CTCGAGCTTCACGGGTTAAAAGCCGATGTCACA－3'(下划线核苷酸部分为 Xho I内切酶 位点)。反向引物5'－AAGCTTATTGCACTCGGGGCCCACGTCATTTA－3'(下划线核苷酸部分为Hind III内切酶位点)。经过BLAST软件进行序列同源性分析，确认靶向基因的特异性后进行实验。引物由北京奥科生物技术公司合成。

2.4 PCR扩增及鉴定 采用Platinum Pfx DNA polymerase(Invitrogen)PCR反应体系，按照试剂盒要求配置。要求配置94℃预变性2 min，94℃ 15 s，55℃ 30 s，68 ℃ 1 min/kb，循环 35次，72 ℃10 min，4℃终止反应。合成产物用基因序列测序证实，并用紫外分光光度计测定产物的浓度及纯度并纪录。

2.5 pGL3重组质粒的构建 用Xho I和Hind III内切酶双酶切 PCR产物，得到PHB－Pro、LDLR－Pro和pGL3－Basic载体，凝胶电泳后从凝胶中提取纯化DNA，回收的片段用T4 DNA连接酶16℃连接过夜，将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，在Amp抗性平板上筛选重组质粒。用SacⅠ和HindⅢ双酶切鉴定并送公司DNA测序。测序正确的重组质粒命名为pPHB－1192、pLDLR－234。

2.6 重组质粒的活性分析 分别将pPHB－1192、pLDLR－234及阴性对照质粒pGL3－Basic转染前列腺癌细胞系PC－3，以未转染质粒的细胞为未转染对照组(NM)，同步进行实验。转染后继续37℃、5%CO2培养箱内孵育48 h后，更换细胞培养液为普通培养基对照组、低胆固醇培养基+胆固醇组(低胆固醇培养基+10 mg/L胆固醇+1 mg/L 25－羟基胆固醇(LPDS+CHO)和低胆固醇培养基组(LPDS)。继续放入37℃、5%CO2培养箱培养48 h。裂解细胞，加入萤光素酶检测试剂，Luminometer Model(Promega)上每孔自动加入100 μL Luciferase Assay Reagent检测萤光值。

3 统计学处理

结 果

1 低胆固醇对PC－3细胞PHB mRNA表达的影响

在低胆固醇培养条件下，PC－3细胞内的PHB表达明显上调，与对照组相比较有显著差异(P＜0.01)，见图 1。

Figure 1.Expression of PHB mRNA increased after CDM treatment.＊＊P ＜ 0.01 vs NM control group.图1 CDM诱导PC－3细胞PHB mRNA表达

2 重组质粒pPHB－1192和pLDLR－234的鉴定

经Xho I和Hind III双酶切后分别可见到大小约全长为1192 bp和234 bp的PHB－Pro和LDLRPro基因片段，约6000 bp处可见pGL3－Basic片段，结果与设计相符，测序结果与目的基因组一致，见图2。

Figure 2.Gel electrophoresis result after plasmid was digested by Xho I and Hind III.M:DNA marker.图2 双酶切后电泳结果

3 重组质粒萤光素酶活性分析

萤光检测结果显示，同空白对照组pGL3比较，实验组pPHB－1192 luciferase表达显著增强，两组比较有显著差异(P＜0.05)，表明转染效率高。同普通培养基组相比较，低胆固醇培养基组luciferase表达显著升高，两组比较有显著差异(P＜0.05)。在低胆固醇培养基组中加入胆固醇，其luciferase表达显著降低，两组比较有显著差异(P＜0.05)，表明低胆固醇诱导PHB在PC－3细胞中表达，见表1。

表1 重组质粒在不同培养基培养的PC－3细胞中萤光素酶表达的比较Table 1.Comparison of luciferase expression of recombinant plasmids in PC－3 cells cultured in different media(.n=3)

表1 重组质粒在不同培养基培养的PC－3细胞中萤光素酶表达的比较Table 1.Comparison of luciferase expression of recombinant plasmids in PC－3 cells cultured in different media(.n=3)

*P ＜0.05 vs LPDS in the same group.

Group LPDS LPDS+CHO NM pGL3 1 1 1 pLDLR －234 9.182 ±0.596 3.208 ±0.276* 4.001 ±0.369*pPHB －1192 70.057 ±2.109 33.615 ±4.063* 39.253 ±2.183*

讨 论

研究发现，肥胖和多种疾病进展有关，进展期的前列腺癌胆固醇升高，高脂肪/胆固醇等“西方饮食”同前列腺癌的发病和进展密切相关［3］。尚未清楚为什么高胆固醇可改变信号分子和导致肿瘤细胞增生，目前研究表明是肿瘤细胞膜上的胆固醇变化导致固醇调节元件结合蛋白(sterol regulatory element－binding protein，SREBP)信号转导，使前列腺癌表现出更强的侵袭性。细胞保持胆固醇的动态平衡的能力在很大程度上受到SREBP转录因子控制。这些SREBP由3个相关的转录因子组成:SREBP－1a、SREBP－1c、SREBP－2。SREBP－1a和 SREBP－1c定位于染色体17q11.2，由SREBP－1基因的不同启动子编码产生。SREBP－1a主要调控胆固醇和脂肪酸合酶，如HMG－CoA以及甘油三酯代谢的LDLR的基因转录;SREBP－1c选择调控脂肪酸、甘油三酯。SREBP－2定位于22q13，主要调控胆固醇合成的甲羟戊酸基因如法呢基焦磷酸合酶和HMG－CoA还原酶［4］。

Heemers等［5］使用2个独立的前列腺癌细胞系(LNCaP和MDA–Pca－2a)并且给予雄激素刺激，证实了在雄激素依赖的前列腺癌细胞系中普遍存在受雄激素协调刺激的LDLR和HMG－CoA表达，并且包括了SREBP途径活化作用。Ettinger等［6］通过对前列腺癌LNCaP异种移植的裸鼠肿瘤模型研究发现，去势后SREBP－1a、－1c和－2呈中等程度升高。在雄激素抵抗期(第21－28 d)，SREBP－1a和1c表达较去势前显著升高。雄激素刺激导致固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白(SREBP cleavageactivating protein，SCAP)增加。SCAP水平升高增加成熟SREBP产生和刺激脂肪生成基因表达。SCAP在去势治疗后降低而在雄激素抵抗期显著升高。Montgomery等［7］分别对于人体原位及转移前列腺癌及裸鼠移植的前列腺癌标本进行研究证实，雄激素抵抗的前列腺癌组织内的类固醇生成酶如FASN、CYP17A1、HSD3B1、HSD17B3、CYP19A1 和 UGT2B17均高于原位前列腺癌。

PHB基因是一种有效的肿瘤抑制基因，因其具有明显的抗细胞增殖、抗肿瘤作用而得名。PHB能抑制细胞增殖，这种作用是细胞周期特异性的，主要在G期－S期之间发挥检查点的作用，抑制核转录因子E2F的转录活性，调控Ras－MAPK信号转导途径，对于细胞生存至关重要［8］。PHB作为雄激素信号的目标蛋白，能够抑制雄激素受体介导的转录和雄激素依赖的前列腺癌细胞增殖。Gamble等［9］研究发现在雄激素刺激增殖的前列腺癌LNCaP细胞中PHB表达下调超过50%，过度表达PHB抑制雄激素刺激的LNCaP细胞增殖，而抑制其表达则促进细胞增殖，提示PHB具有调控前列腺癌细胞增殖作用。此后研究证实，PHB作为雄激素受体(androgen receptor，AR)的核共遏制物，可能在前列腺癌进展为雄激素非依赖过程中发挥作用［10］。

研究发现，低氧条件下小鼠肝细胞膜和线粒体PHB水平依次增加，提示其在细胞感受外界环境氧变化、相关的细胞内信号转导及低氧时细胞内的调节机制中发挥保护作用［11］。另外，PHB能够抑制E2F介导的转录，从而保护人RAMOS B淋巴细胞免受DNA拓扑异构酶I抑制剂喜树碱诱导的细胞凋亡［12］。在雌激素拮抗剂治疗的乳腺癌细胞中同样发现，PHB和共阻遏物 Brg1/Brm的高表达，PHB与E2F1和p53共定位到细胞核并能增强E2F1和p53介导的转录活动［13］，从而发挥抗凋亡作用。这些研究表明，PHB通过抑制E2F介导的细胞转录发挥抑制细胞增殖的作用，从而使肿瘤细胞逃避雌激素拮抗剂诱导的细胞凋亡，最终导致激素非依赖性进展。

本研究以前列腺PC－3细胞为细胞模型，采用real－time PCR证实，在普通培养基中PC－3细胞中PHB mRNA低水平正常表达，在胆固醇缺乏条件作用48 h后，PHB表达显著上调。克隆PHB启动子基因片段并构建转染质粒，并以LDLR启动子质粒作为阳性对照，结果表明，PHB启动子质粒在前列腺癌PC－3细胞中显示出良好的转录活性，且在低胆固醇培养细胞中显著表达上调。PHB上调抑制肿瘤细胞增殖，从而促进肿瘤细胞逃避抗肿瘤药物和不良因素导致的细胞凋亡，这可能是前列腺癌内分泌治疗有限、雄激素抵抗进展的重要原因之一。

由于本实验仅在体外检测了前列腺癌雄激素非依赖PC－3细胞中PHB表达情况，下一步实验需要对多种前列腺癌细胞株进行检测，并进一步分析PHB中胆固醇敏感作用位点，同时需模拟体内环境，构建实验动物模型，为理解前列腺癌发生、发展和临床前列腺癌治疗和预防提供理论依据。

［1］Freedland SJ，Williams CD，Masko EM.Adiponectin and prostate cancer mortality:to be or not to be skinny?［J］.Clin Chem，2010，56(1):1 －3.

［2］Zadra G，Priolo C，Patnaik A，et al.New strategies in prostate cancer:targeting lipogenic pathways and the energy sensor AMPK［J］.Clin Cancer Res，2010，16(13):3322－3328.

［3］Davies BJ，Smaldone MC，Sadetsky N，et al.The impact of obesity on overall and cancer specific survival in men with prostate cancer［J］.J Urol，2009，182(1):112 －117.

［4］Horton JD，Shah NA，Warrington JA，et al.Combined analysis of oligonucleotide microarray data from transgenic and knockout mice identifies direct SREBP target genes［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2003，100(21):12027 －12032.

［5］Heemers H，Maes B，Foufelle F，et al.Androgens stimulate lipogenic gene expression in prostate cancer cells by activation of the sterol regulatory element－binding protein cleavage activating protein/sterol regulatory elementbinding protein pathway［J］.Mol Endocrinol，2001，15(10):1817－1828.

［6］Ettinger SL，Sobel R，Whitmore TG，et al.Dysregulation of sterol response element－binding proteins and downstream effectors in prostate cancer during progression to androgen independence［J］.Cancer Res，2004，64(6):2212 －2221.

［7］Montgomery RB，Mostaghel EA，Vessella R，et al.Maintenance of intratumoral androgens in metastatic prostate cancer:a mechanism for castration－resistant tumor growth［J］.Cancer Res，2008，68(11):4447 －4454.

［8］Rajalingam K，Wunder C，Brinkmann V，et al.Prohibitin is required for Ras－induced Raf－MEK－ERK activation and epithelial cell migration［J］.Nat Cell Biol，2005，7(8):837－843.

［9］Gamble SC，Odontiadis M，Waxman J，et al.Androgens target prohibitin to regulate proliferation of prostate cancer cells［J］.Oncogene，2004，23(17):2996 －3004.

［10］Gamble SC，Chotai D，Odontiadis M，et al.Prohibitin，a protein downregulated by androgens，represses androgen receptor activity［J］.Oncogene，2007，26(12):1757 －1768.

［11］孙鲁宁，张静萍，孙摇娇，等.低氧培养小鼠肝细胞膜蛋白的蛋白质组学研究［J］.中国病理生理杂志，2011，27(2):338－342.

［12］Fusaro G，Wang S，Chellappan S.Differential regulation of Rb family proteins and prohibitin during camptothecininduced apoptosis［J］.Oncogene，2002，21(29):4539－4548.

［13］Wang S，Zhang B，Faller DV.BRG1/BRM and prohibitin are required for growth suppression by estrogen antagonists［J］.EMBO J，2004，23(11):2293 －2303.