K－ras反义核酸抑制肺腺癌细胞A549的生长*

李尊岭， 邵淑红， 焦 飞， 岳 真， 李有杰

(滨州医学院1生物化学与分子生物学教研室，分子遗传学研究所，2应用心理学教研室，山东 烟台 264003)

ras基因家族主要有3个成员:K－ras、H－ras和 N －ras，分别定位于 12p1、11p15、1p22，其编码的蛋白质主要是高度保守的小G蛋白，该蛋白有188－189个氨基酸组成，定位于细胞膜内侧，是控制细胞外向细胞内信号转导途径的关键“开关分子”［1］。Ras蛋白主要通过以下信号转导途径，促进细胞的增殖:表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)等信号分子与受体结合后，受体二聚化，激活其蛋白激酶的活性，使受体自身酪氨酸残基磷酸化，形成SH2结构域，进而结合接头蛋白Grb2，活化SOS(son of sevenless)蛋白;活化的SOS蛋白结合Ras蛋白，使Ras蛋白释放GDP，结合GTP，最终通过Ras/Raf和Rho/Rac通路，促进细胞增殖、抑制细胞凋亡［2］。

K－ras基因的突变和过度表达与肺癌的发生、发展和预后有着密切关系。有研究表明，在非小细胞肺癌(non－small cell lung cancer，NSCLC)尤其是腺癌中，60%的K－ras基因存在突变或过表达，主要是第12位密码子中的鸟嘌呤(G)被胸腺嘧啶(T)取代，从而导致 K－Ras蛋白丧失了GTP酶的活性，持续活化，使传递到细胞内效应器上的刺激大为延长，最终导致细胞异常增殖，发生癌变。已有报道表明肺腺癌细胞A549中存在 K－ras基因的突变［3］。研究表明早期肺腺癌中，K－ras基因突变患者的5年生存率比没有基因突变患者的5年生存率明显短。Suda等［4］发现在晚期肺腺癌患者中，K－ras基因突变患者的生存时间明显短于无突变患者。以上资料表明:K－ras基因在肺腺癌中突变或过表达是一个大概率事件;无论是早期还是晚期肺癌患者，K－ras基因突变或过度表达，都能显著降低病人的5年生存率。

本研究检测了K－Ras蛋白在6例肺腺癌标本、正常毗邻肺组织和 A549细胞中的表达，以验证K－ras基因在肺腺癌中高表达的结论。另外，我们构建了K－ras的反义表达载体，经脂质体转染A549细胞，观察细胞生长及凋亡情况，并检测细胞周期相关蛋白细胞周期素A(cyclin A)、细胞周期素D1(cyclin D1)、细胞周期素E(cyclin E)、细胞周期素依赖性激酶2(cyclin－dependent kinase 2，CDK2)和细胞周期素依赖性激酶4(cyclin－dependent kinase 4，CDK4)，以及凋亡相关蛋白caspase－3、P53和Rb的表达，旨在探讨K－ras反义核酸在肺癌基因治疗中的作用及机制。

材料和方法

1 细胞及试剂

本研究所用的人肺腺癌细胞A549细胞株和质粒pcDNA3.1(+)载体由本研究所保存。6例肺腺癌标本和毗邻组织由滨州医学院附属医院提供。RPMI－1640培养基、胎牛血清由HyClone提供。抗Caspase－3、P53、Rb、cyclin A、cyclin D1、K － Ras抗体由 Santa Cruz Biotechnology提供，抗 cyclin E、CDK 2和CDK4抗体由 Cell Signaling Technology提供。K－ras反义寡核苷酸引物由北京赛百盛生物科技有限公司合成。T4 DNA连接酶、EcoR I内切酶和Hind III内切酶均购自Fermentas，胶回收试剂盒购自大连宝生物生物技术有限公司。Lipofectamine 2000 reagent kit购自Invitrigen，Annexin V试剂盒购自碧云天生物有限公司。

2 方法

2.1 实验分组 根据实验要求，将A549细胞分为空白对照组(不进行任何处理)、空载体组(仅转染了载体质粒)和转染组(转染了K－ras反义表达载体)。

2.2 K－ras反义表达载体的构建 以人 K－ras基因(NM－004985)exon 1为模板，应用Primer 5.0软件设计该基因的特异引物，序列为上游5＇－ GCGGAATTCCGGCTCGGCCAGTACTCC －3＇(下划线为EcoR I酶切位点)，下游5＇－ GCGAAGCTTCTCTTGCCTACGCCACCA －3＇(扩展片段大小为 200 bp，下划线为Hind III酶切位点)。应用DNA提取试剂盒(TaKaRa生物工程有限公司)，从肺腺癌细胞A549中提取基因组DNA。PCR扩增K－ras反义片段，条件为:95℃ 5 min预变性后，94℃ 45 s，62℃ 1 min，72℃ 30 s，30个循环后，72℃ 10 min。将扩增后的目的片段和pcDNA3.1(+)载体应用EcoR I和Hind III进行双酶切，酶切体系为:K－ras片段或pcDNA3.1(+)载体10 μL、10 × buffer R 2 μL、EcoR I和Hind III各2 μL、双蒸水 4 μL，总体系为20 μL，37 ℃孵育6 h。胶回收试剂盒回收目的片段(按照说明书进行)。T4 DNA连接酶进行连接，具体操作如下:pcDNA3.1(+)载体片段0.5 μL、K－ras目的片段1 μL、T4 DNA 连接酶 1 μL，10 × buffer 1 μL、双蒸水6.5 μL，总体系 10 μL，22 ℃孵育 5 h。对连接产物进行电泳和PCR鉴定，获得阳性克隆，并测序(北京拜尔特普生物技术有限公司完成)验证连接的正确性［5］(命名为 antisense－ K －ras－pcDNA3.1)。

2.3 转染 详细操作步骤按照Lipofectamine 2000 reagent kit说明书进行操作。

2.4 MTT测细胞增殖情况 取96孔板，接种1×104个细胞，常规培养，转染96h后，PBS洗涤细胞1次，每孔加0.1 mL PBS和10 μL MTT染液，继续培养6 h，每孔加0.1 mL二甲基亚砜(DMSO)，在振荡器上振荡混匀，让还原产物充分溶解。置酶联检测仪上测定吸光度(A)值，检测波长570 nm。

2.5 Annexin V检测细胞凋亡 常规培养细胞，转染96 h后，PBS洗涤2次，应用binding buffer结合并悬浮细胞，加入1 μL Annexin V－FITC混匀后加入5 μL 碘化丙啶(propidium iodide，PI)进行标记，室温避光反应5 min，应用荧光显微镜观察细胞凋亡情况。

2.6 Western blotting检测相关蛋白的表达 细胞总蛋白应用细胞蛋白裂解液进行提取，超声10 s，12000 r/min离心20 min收集上清。应用Bradford试剂盒进行蛋白定量，等量的细胞总蛋白(每个泳道80 μg)应用10%的SDS－PAGE胶进行电泳、转膜、封闭、杂交，Ⅰ抗应用兔抗 caspase－3、P53、Rb和鼠抗 cyclin A、cyclin D1、cyclin E、CDK2和 CDK4 抗体，Ⅱ抗采用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔、山羊抗鼠抗体，ECL荧光试剂盒进行曝光、显影、定影、压片。实验重复3次，以目的蛋白和GAPDH吸光度比值作为目的基因的相对表达量。

3 统计学处理

结 果

1 K－ras反义核酸表达载体的构建

本研究应用PCR的方法，扩增K－ras exon 1反义片段，电泳后在200 bp显示有一条带，见图1，与目的片段大小相吻合，表明 K－ras exon 1反义片段扩增正确(测序结果进行了证实)。应用EcoR I和Hind III对空白载体pcDNA3.1(+)进行双酶切，电泳后在4000 bp显示单一条带，且条带整齐，无弥散和多条带现象，表明成功对pcDNA3.1(+)空白载体进行了双酶切，见图1。应用胶回收试剂盒对以上 K－ras exon 1反义片段和pcDNA3.1(+)双酶切片段进行回收，电泳结果显示在200 bp和4000 bp各有一整齐条带，表明片段回收正确，在回收过程中无条带断裂等现象，见图1。应用T4 DNA连接酶对以上回收的目的片段进行连接，由于电泳的方法较难区分4000 bp和4200 bp条带，本实验采用菌落PCR的方法对阳性克隆进行鉴定。阳性克隆菌落组电泳结果显示在200 bp有一整齐条带，而阴性对照PCR扩增后，电泳结果没有任何条带，见图1，表明成功构建了K－ras exon 1的反义表达载体(测序证实了该结果的正确性)。

Figure 1.The construction of antisense K－ras exon 1 expression vector.M:marker;1:the fragment of K －ras exon 1 and its length was 200 bp;2:the fragment of pcDNA3.1(+)vector digested by EcoR I and Hind III;3:the purification result of digested pcDNA3.1(+)vector;4:the purification result of digested K－ras exon 1;5:negative control that the template was the pcDNA3.1(+)vector;6:positive result that its sequence was identified.图1 K－ras exon 1反义表达载体的构建

2 K－Ras蛋白在肺腺癌标本和A549细胞中的表达

Western blotting检测6例肺腺癌标本、毗邻正常组织和A549细胞中K－Ras蛋白的表达结果显示，与正常毗邻组织相比较，6例标本中有4例标本K－Ras蛋白高表达，阳性率为66.7%;在A549细胞中，K－ras蛋白高表达，见图2。

Figure 2.The expression of K－Ras in lung samples and A549 cells.A:A549 cells and lung adenocarcinoma samples(S1 －S6);B:paired adjacent normal samples.图2 K－Ras蛋白在肺标本和A549细胞中的表达

3 反义核酸抑制K－Ras蛋白在A549细胞中的表达

转染96 h后，各组细胞中 K－Ras蛋白的表达结果显示antisense－K－ras－pcDNA3.1能够明显抑制K－ras基因的表达，抑制率可以高达70%，见图3。

Figure 3.The expression of K －Ras in different groups.1:A549 cells;2:A549 cells transfected by pcDNA3.1;3:A549 cells transfected by antisense－ K－raspcDNA3.1.图3 K－Ras蛋白在不同实验组的表达

4 Annexin V检测细胞凋亡

转染antisense－ K－ras－pcDNA3.1的 A549细胞出现明显的凋亡现象，表现为发红色荧光的细胞明显增多，见图4。

5 MTT测细胞生长曲线

在细胞培养的前3 d，细胞生长未见明显差异。从第4 d开始，转染antisense－ K－ras－pcDNA3.1的细胞开始出现明显的生长抑制现象(P＜0.01)，见图5。

Figure 4.The apoptosis among different groups(× 400).A:A549 cells;B:A549 cells transfected by pcDNA3.1(+);C:A549 cells transfected by antisense－ K －ras－pcDNA3.1.图4 不同实验组细胞凋亡

Figure 5.The growth curves in different groups..n=3.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control.图5 不同实验组细胞生长曲线

6 Western blotting检测相关蛋白表达

与空白对照组和空载体组相比较，转染反义K－ras的细胞中 G1/S期相关蛋白 cyclin A、cyclin D1、cyclin E、CDK2和 CDK4的表达明显降低(均 P＜0.05)。抑癌蛋白 Rb、P53和凋亡相关蛋白caspase－3的表达明显升高(均P＜0.01)，而空载体组和空白组，上述蛋白的表达没有明显差异，见图6。

讨 论

Figure 6.The expression of cyclin A，cyclin D1，cyclin E，CDK2，CDK4，Rb，P53 and caspase－3.1:control;2:pcDNA3.1(+);3:antisense－K－ras－pcDNA3.1..n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control.图6 各目的蛋白的表达分析

反义核酸技术是根据碱基互补原理用人工合成或生物体合成的特定DNA或RNA片段抑制或封闭基因表达的技术。根据核酸杂交原理，反义核酸可以从基因表达调控的多个层次干扰基因表达，最主要的作用靶点是在转录和翻译起始阶段的调控，最终抑制靶基因的表达，达到治疗和预防某些疾病的目的。目前，反义核酸疗法已在肿瘤学研究中广泛应用，有些已经进入了实验和临床阶段，主要靶基因集中于癌基因和细胞生长因子等领域［6］。

K－ras基因是最早发现的癌基因之一，其编码的蛋白质是小G蛋白，结合GTP后被激活，水解GTP后活性丧失，是酪氨酸蛋白激酶信号转导途径中的关键分子。目前，利用反义核酸技术封闭 K－ras基因表达的研究已经渗透到癌症研究的各个领域在肺癌、胰腺癌、甲状腺癌、结肠癌等多个癌症领域，都有反义K－ras抑制癌细胞生长的报道。有研究表明［7］，利用反义核酸技术，针对 K －ras基因第2、第3外显子以及两侧2.0 kb的核酸序列，设计相应的反义核酸，转染肺癌细胞H460后，K－ras基因表达的抑制可以高达90%以上，而且在动物实验中，癌细胞丧失了致瘤能力。还有研究［8］利用 K－ras反义核酸封闭K－ras基因表达后，能够明显抑制肺癌的转移和裸鼠致瘤能力，而且相同的结果也出现在胃癌细胞的研究中，但是反义 K－ras抑制肿瘤细胞生长的作用机制报道较少。

本研究6例肺腺癌标本中，有4例高表达KRas，阳性率为66.7%，而且在A549细胞中 K－Ras蛋白高表达，验证了文献报道中K－Ras蛋白在肺腺癌中高表达的结论，为接下来的研究奠定了基础。接着，本研究利用反义核酸技术，针对K－ras基因exon 1，设计了反义核酸引物序列，并进行硫代化修饰，构建了针对K－ras的反义核酸表达载体，转染肺腺癌A549后，Western blotting检测K－Ras蛋白的表达，从中选出了抑制作用最强的一条反义核酸;转染A549细胞后，发现细胞凋亡较明显，而且细胞生长明显受到抑制，表明封闭 K－ras基因表达后，能够抑制细胞的生长，促进细胞凋亡。

另外，在转染反义 K－ras的细胞中，G1/S期相关蛋白 cyclin A、cyclin D1、cyclin E、CDK2 和 CDK4的表显著降低，而抑癌蛋白Rb、P53以及凋亡蛋白caspase－3的表达明显升高，表明封闭 K－ras基因表达后，促进细胞周期进行和DNA合成的相关蛋白表达降低，而抑制细胞生长、促进细胞凋亡的相关蛋白表达增加。

在细胞周期调控过程中，cyclin和CDK形成复合物调控细胞周期的进行。CyclinD1/CDK4和cyclin E/CDK2形成复合物后，促进了细胞从G1期进入S期，而cyclin A/CDK2形成复合物后，促进了S期中DNA合成的起始［9］。Rb蛋白是一个抑癌蛋白，通过抑制转录因子E2F的活性，使细胞停滞在G1期;p53是目前发现的最经典的抑癌基因，在DNA损伤修复和促进凋亡方面发挥着重要作用。Caspase－3是促凋亡蛋白，在细胞凋亡过程中，发挥着重要作用［10］。

Cyclin D1/CDK4和cyclin E/CDK2复合物形成后，使Rb蛋白磷酸化，释放转录因子E2F，游离的E2F又可以促进其自身、cyclin D、CDK2和cyclin E等的合成，进一步促进Rb蛋白的磷酸化，释放更多的E2F，形成一种正反馈，最终促进DNA的合成，使细胞顺利通过G1/S期转折点［11］。在这个过程中cyclin A与CDK2形成复合物促进了DNA复制的起始，启动DNA的复制。P53蛋白通过促进G1期特异的细胞周期抑制物p21蛋白和DNA损伤修复诱导蛋白Gadd 45的表达，使DNA受损细胞不再分裂，细胞停留在 G1期［12］。

综上所述，K－ras基因反义核酸能抑制肺腺癌A549细胞的生长，促进细胞凋亡，其机制可能与cyclin A、cyclin D1、cyclin E、CDK2、CDK4 的表达降低和caspase－3、P53、Rb的表达升高有关。

［1］Younes N，Fulton N，Tanaka R，et al.The presense of K－12 ras mutations in duodenal adenocarcinomas and the absence of ras mutations in other small bowel adenocarcinomas and carcinoid tumors［J］.Cancer，1997，79(9):1804－1808.

［2］Ma P，Magut M，Faller DV，et al.The role of Ras in T lymphocyte activation ［J］.Cell Signal，2002，14(10):849－859.

［3］王启钊，刁 勇，吕颖慧，等.突变型 K－ras siRNA抑制肺癌A549细胞的增殖和迁移并诱导细胞凋亡［J］.中国肿瘤生物治疗杂志，2009，16(6):564－569.

［4］Suda K，Tomizawa K，Mitsudomi T.Biological and clinical significance of KRAS mutations in lung cancer:an oncogenic driver that contrasts with EGFR mutation［J］.Cancer Metastasis Rev，2010，29(1):49 －60.

［5］李尊岭，邵淑红，谢书阳，等.CyclinD1反义核酸诱导肺腺癌细胞A549的凋亡［J］.生理学报，2011，63(3):261－266.

［6］Lozano MD，Zulueta JJ，Echeveste JI，et al.Assessment of epidermal growth factor receptor and K－ras mutation status in cytological stained smears of non－small cell lung cancer patients:correlation with clinical outcomes［J］.Oncologist，2011，16(6):877 －885.

［7］Findeiss S，Schmidtke C，Stadler PF，et al.A novel family of plasmid－transferred anti－sense ncRNAs［J］.RNA Biol，2010，7(2):120 －124.

［8］Dancey JE.Agents targeting ras signaling pathway［J］.Curr Pharm Des，2002，8(25):2259 －2267.

［9］Akli S，Keyomarsi K.Cyclin E and its low molecular weight forms in human cancer and as targets for cancer therapy［J］.Cancer Biol Ther，2003，2(4 Suppl 1):S38－S47.

［10］叶 孟，林 蕾，潘宏铭，等.Caspase 3抑制剂羟基喜树碱对人乳腺癌Bcap37细胞 NF－κB的激活［J］.中国病理生理杂志，2007，23(8):1508 －1511.

［11］刘 娟，殷 飞，姚树坤.细胞周期素D1、视网膜母细胞瘤样蛋白2及微小染色体维持蛋白7在肝细胞癌中的表达及对预后的意义［J］.中国病理生理杂志，2011，27(2):304 －309.

［12］Shih RS，Wong SH，Schoene NW，et al. Enhanced Gadd45 expression and delayed G2/M progression are p53－dependent in zinc－supplemented human bronchial epithelial cells［J］.Exp Biol Med，2010，235(8):932 －940.