心肌营养素1诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞*

彭朝权， 高 雅， 项 鹏， 杨 珂， 邹丽媛， 吴 晓

(1中山大学附属第三医院心内科，广东 广州 510630;2中山大学干细胞与组织工程研究中心，广东 广州 510080)

缺血性心脏病是全球高发的疾病之一，其本质是心肌细胞的不可逆丧失。目前临床积极进行溶栓、介入等再灌注治疗，但仍缺乏针对已经梗死心肌细胞再生的根本性治疗方法，梗死心肌形成无收缩功能的瘢痕组织，导致心功能改变，最终导致心衰。干细胞的发现与再生医学的发展为心肌细胞的再生带来了新的希望，其中，成体骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)易于获取、扩增，具有多分化潜能，且免疫源性较低［1］，甚至具有免疫抑制作用［2］，是心肌细胞再生有前途的种子细胞。近年来，以5－氮杂胞苷(5－azacytidine，5－Aza)为先驱和代表，将MSCs诱导分化为有功能、乃至有电活动的心肌细胞的研究始终在进行［3］。新的诱导剂大致分为如下几类:(1)细胞因子类，如血管内皮生成因子，胰岛素样生长因子，肝细胞生长因子，碱性成纤维细胞生长因子等;(2)炎症因子类如白细胞介素－6，肾素、血管紧张素－Ⅰ、血管紧张素－Ⅱ等;(3)中医药类如黄芪甲甙、双地龙、丹参酚酮、淫羊藿等。

心肌营养素1(cardiotrophin 1，CT－1)是白细胞介素－6细胞因子家族的一员，最早发现其促进细胞肥大的作用，在先天性心脏病、心肌病、进行性心力衰竭和心肌梗死等病理过程中均有过度表达。而CT－1诱导大鼠MSCs向心肌样细胞分化的研究亦在进行［4］，其结果提示:CT－1可辅助5－Aza提高诱导率，但未能独立将MSCs诱导为心肌细胞。因此，本研究将探讨CT－1在MSCs诱导分化为心肌细胞中的作用，明确其诱导功效。

材料和方法

1 材料

1.1 动物 小型猪1头，6月龄，体重26 kg，雌性，南方医科大学动物实验中心提供(实验动物合格证明编号No.0038589)。

1.2 主要器材 超净工作台，调温低速离心机(Eppendorf)，微型高速离心机(Eppendorf)，Shel Lab 2323－2 CO2孵箱(Shel Lab)，倒置显微镜(Olympus)，电子天平，恒温水浴箱(Shel Lab)，纯水仪，摇床，骨髓穿刺包等。

1.3 主要试剂 CT－1(Invitrogen)，5－Aza(Sigma)，1073 g/L Ficoll人淋巴细胞分离液(Pharmacia)，鼠抗猪α－actin单克隆抗体(Santa Cruz)，羊抗猪心肌特异性肌钙蛋白T(cardiac specific troponin T，cTnT)多克隆抗体(Abcam)，TRITC标记的羊抗小鼠 IgG(Protein Tech Group)，Hoechst染色液，DMEM－F12培养基，胎牛血清，胰蛋白酶，肝素钠注射液，Triton X－100，速眠新及4%多聚甲醛等。

2 方法

2.1 原代骨髓MSCs的分离、培养及扩增 全麻后，穿刺小型猪髂后上棘多点吸取约40－50 mL骨髓液(等量 PBS稀释，肝素抗凝);加入 Ficoll液，2000 r/min离心20 min;吸取白膜层，加入等量PBS，1100 r/min离心4 min;去上清，加入用含 10%FBS的L－DMEM培养基重悬，按(2－3)×105/cm2的浓度接种于6孔板，置37℃、5%CO2、饱和湿度的孵箱培养。细胞80% －90%融合时，0.25%的胰蛋白酶消化，按1∶2比例传代扩增至第4－6代，取对数生长期MSCs，消化离心，按1×107/L接种于24孔板，37℃、5%CO2、饱和湿度下培养。加入DMSO 250 μL，振荡10 min。

2.2 MSCs分化能力的鉴定

①成骨诱导 将细胞按2×104/cm2密度接种于6孔板，生长至80%时，加成骨诱导液诱导，约12 d可见细胞聚集为钙化结节，逐渐增多增大，21 d后钙化结节行茜素红染色。

②成脂诱导 将细胞按2×104/cm2密度接种于6孔板，生长至80%时，加成脂诱导液A诱导，3 d后换液并再予成脂B液诱导，如此循环约至14 d行油红O染色。

2.3 多组诱导分化 将MSCs均匀接种于12孔板，每张板上分为4组，每组共3孔，组内处理方法相同，A:空白对照组(无血清培养基);B:5－Aza组(含10 μmol/L 5－Aza的无血清培养基);C:CT－1组(含0.1 μg/L CT－1的无血清培养基);D:合用组(10 μmol/L 5 －Aza+0.1 μg/L CT －1 的无血清培养基)。当细胞增殖至每孔面积的80%时，加入上述浓度诱导液作用24 h，用原10%胎牛血清培养基的L－DMEM换液，于 37℃、5%CO2的孵育箱中培养，不加任何干扰因素，隔3 d换液，观察细胞形态。免疫荧光检测以及计算细胞荧光阳性率:取诱导后28 d的细胞行α－actin和cTnT免疫荧光染色，并计数诱导后28 d各组细胞的阳性染色率。(1)0.01 mol/L PBS洗涤;(2)4%多聚甲醛固定，0.01 mol/L PBS洗涤;(3)0.2%Triton X－100穿透半小时，0.01 mol/L PBS洗涤;(4)滴加10%正常山羊血清封闭细胞;(5)弃血清后分别加入Ⅰ抗α－actin，cTnT(0.01 mol/L PBS 1∶200稀释)，阴性对照组用0.01 mol/L PBS替代;(6)湿盒中保存，4℃过夜;(7)予0.01 mol/L PBS洗涤;(8)在避光条件下加入TRITC结合1 h，予0.01 mol/L PBS洗涤;(9)Hoechst染色法染细胞核10 min，予0.01 mol/L PBS洗涤;(10)荧光显微镜下观察，分别观测蓝色、红色荧光。计数每个视野内的细胞数(N)和红色荧光阳性细胞数(Ni);计算MSCs分化为心肌样细胞的转化率(Ni/N×100%)。

3 统计学处理

应用SPSS 13.0统计软件对数据进行分析，数据以均数±标准差()表示。

结 果

1 西藏小型猪MSCs的培养情况

接种到6孔板的原代细胞，被大量红细胞覆盖，24 h后首次换液，隐约可见孔底少量贴壁细胞，1周可见多个长梭形细胞集落，见图1A，核圆居中，含1－3个核仁。约12 d首次按2×104/cm2密度传代，细胞贴壁后形态如前，约9－12 d密集生长至80%－90%，见图1B，传代继续培养。

Figure 1.Morphology of the MSCs under an inverted microscope(×100).A:6 d after inoculation，spindle－shaped cells were observed;B:12 d after inoculation，MSCs reached 80% －90%.图1 相差显微镜下MSCs形态学观察

取第4代细胞行成骨诱导，约12 d可见细胞聚集为钙化结节，逐渐增多增大，21 d后钙化结节茜素红染色阳性，见图2A。进行成脂诱导，7 d后，细胞已由长梭形变为多角形，细胞体积逐渐增大，胞质内有圆球形半透明脂滴形成，部分细胞胞核挤向一侧，第14 d行油红O染色，胞核周围红染，见图2B。

Figure 2.Osteogenic and adipogenic differentiation.A:alizarin red staining for osteogenesis on day 21，showing orange－red calcium nodules(×200);B:oil red O staining for adipogenesis on day 14(×400).These results indicate that MSCs are multipotent.图2 MSCs成骨成脂分化结果

2 MSCs向心肌细胞诱导分化

诱导剂诱导后第14 d起，可见除空白对照组外，各组均有部分细胞形态变宽，体积逐渐增大，约21 d起，可见细胞生长减慢，细胞回缩变短，细胞聚集生长趋势，细胞排列具有明显的方向性，具有短棒状结构及位于中心的细胞核，核/浆比例明显降低，见图3。培养至28 d，上述倾向仍明显，但各组均有部分细胞形态渐趋扁平，胞核扁圆，出现空泡，并有少量细胞失去规则形态，核仁消失，细胞死亡。

Figure 3.Morphology of MSCs 28 d after induction with 5－Aza(×100).图3 5－Aza诱导后28 d光镜下观察

3 细胞免疫荧光结果

按每组1个孔选3个400倍视野计数3次，取Hoechst法蓝染的细胞核数为MSCs细胞总数，取明亮以及可见红色荧光的细胞为阳性细胞。在荧光显微镜下，分别观察各组蓝色、红色荧光的表达，并合成于同一幅图片中，记录其红色荧光表达率。免疫荧光染色结果显示，阴性对照组及空白对照组可见极少量红色荧光光点，略呈圆形，形状较正常MSCs小，有些周围未见显示蓝色荧光的细胞核，提示可能为杂质所导致的假阳性，见图4A、E。CT－1组、5－Aza组和合用组均可见部分细胞显示红色荧光，与显示蓝色荧光的细胞核重合。其中，合用组红色荧光细胞数最多，见图4B、C、D、F、G、H。其中 CT －1 组具有较典型的红色荧光细胞的表达。

Figure 4.Immunofluorescence staining results in each group(×100).A:Hoechst nuclear dye in control group;B:Hoechst nuclear dye in CT－1 group;C:Hoechst nuclear dye in 5－Aza group;D:Hoechst nuclear dye in CT－1 and 5－Aza group;E:red fluorescence in control group;F:red fluorescence in CT－1 group;G:red fluorescence in 5－Aza group;H:Red fluorescence in CT－1 and 5－Aza group.图4 各组细胞免疫荧光染色结果

4 各组分化为心肌细胞阳性率比较

由图5可见，合用组的诱导分化心肌样细胞αactin阳性率为29.90% ±4.76%，明显大于5－Aza组(17.73% ±2.35%，P＜0.01)、CT－1组(6.63%±0.55%，P＜0.01)和空白对照组(1.62% ±0.09%，P＜0.01);5－Aza组明显大于CT－1组(P＜0.01)和空白对照组(P＜0.01);CT－1组明显大于空白对照组(P＜0.05)。

cTnT红色荧光染色结果显示，合用组的诱导分化心肌样细胞cTnT阳性率为36.50% ±4.09%，明显大于5－Aza组(14.37% ±1.65%，P＜0.01)、CT－1组(7.50% ±0.61%，P＜0.01)和空白对照组(1.12% ±0.23%，P＜0.01);5－Aza组明显大于CT－1组(P＜0.01)和空白对照组(P＜0.01);CT－1组明显大于空白对照组(P＜0.01)。

讨 论

Figure 5.The percentage of positive expression of α － actin and cTnT in each group..n=3.＊＊P＜0.01 vs contnol;##P＜0.01 vs CT－1 or 5－Aaz group.图5 各组诱导分化细胞α－actin和cTnT阳性表达率

干细胞和前体细胞再生潜能的发现为从根本上治疗心肌梗死和预防心梗后心衰提供了可能性，因此心肌细胞再生的实验研究与临床探索均在蓬勃开展［5］。MSCs易于获取、分离、扩增，以及弱的免疫抗原性，尤其是易于外源基因的导入［6］，且可保持其未分化特性，为作为基因载体治疗遗传缺陷性疾病奠定了基础。要提高MSCs的疗效，经基因修饰过度表达血管生成因子［7］、生长因子或干细胞归巢因子等细胞因子作为旁分泌因子均为目前的研究热点。动物实验发现经过修饰的MSCs治疗急性心肌梗死，比单纯的细胞治疗组和基因治疗组能更好地改善心肌灌注、修复心脏功能［8］。另外，由于猪的心脏功能与结构均与人类相似度最高，是最常用的大型动物。因此，本课题选择西藏小型猪MSCs为研究对象，为进一步的在体实验打下基础。此外，本实验通过对细胞贴壁率及细胞活力观察，表明我们分离到的西藏小型猪MSCs的存活能力很强，细胞稳定，存活率高，细胞生长状况好。而对其分化潜能的测定方面，成骨与成脂均获得较好的诱导效果，提示其具有良好的分化潜能。

CT－1是IL－6细胞因子家族的一员，能促使体外心肌细胞肥大，遂命名为心肌营养素 1［9］。在1995年研究高血压心肌细胞肥大时被首次发现［10］，后来CT－1又被发现在多种心脏病理过程中，均有过度表达，乃至于一段时间内被作为心血管疾病生物标记物被研究，进一步研究提示其水平的升高或许是机体的一种保护性反应，在对保持心脏正常功能及心脏疾病的发生、发展方面有重要意义［11］。gp130是IL－6细胞因子家族共有的信号转导分子，为I型膜蛋白分子，由3部分组成:与配体结合的胞外区、有激酶活性的胞内区和跨膜区。gp130蛋白含918个氨基酸，其中信号肽和跨膜区各22个残基，胞外区和胞浆区分别含597和277个残基［12］。在心肌细胞，CT－1通过2条途径起作用:一条是通过激活蛋白激酶/信号转导子和转录激活子信号转导通路(JAK/STAT3)途径引起心肌肥大和保护心肌［9，12］。CT－1先与心肌细胞上的跨膜受体gp130/LIFR结合，gp130和白血病抑制因子受体β亚基酪氨酸磷酸化，促进二聚体，并与其特异性α受体结合，从而激活与受体相连的JAK1、JAK2和Tyk2等，并使信号转导子与转录激活物3(STAT3)酪氨酸磷酸化形成二聚体，再转位至核内与靶基因增强子元件结合激活转录，产生一系列与心肌肥厚有关的效应。Liao等［13］的研究亦表明，在心肌缺血－再灌注后注射CT－1能明显对抗心肌缺血引起的损伤，这种保护作用通过苏氨酸磷酸化激活蛋白激酶信号转导通路(MAPK通路)的抑制而被拮抗，应用的MAPK特异性抑制剂PD98059能够阻止MAPK的激活，阻断CT－1促进心肌细胞生存的作用，导致细胞活力丧失。而有研究认为，MAPK途径与分化终末的细胞存活有关［14］。亦有研究发现，当MAPK通路受抑制的同时，STAT3过度表达所诱导的心肌细胞肥大、部分mRNA的表达以及蛋白的合成也被抑制，说明这2条信号转导通路在心肌细胞肥大中发生了“交叉对话”，互相影响，互相联系，形成复杂的网络系统，进而表现为CT－1的多种生物学功能［15］。

Makino等［3］将从小鼠骨髓中分离出的MSCs连续传代，得到永生型细胞，在5－Aza的作用下诱导分化，1周后观察到约30%MSCs细胞形态发生改变，细胞体积变大，向同一方向延展成棒状，2周后与周围细胞相连。3周后通过闰盘与相邻细胞连接，形成微管样结构。此后国内外多次报道并证实相关结论。从而为MSCs诱导分化成为心肌细胞用于细胞移植与基因治疗提供了实验依据。但上述相关报道的动物模型多为以啮齿类动物如大鼠、小鼠。

关于大型动物模型西藏小型猪MSCs经5－Aza诱导分化为心肌细胞的报道尚不多见。因此本课题选择5－Aza作为阳性对照的诱导剂，并在预实验中尝试了从2.5 μmol/L到20 μmol/L等多种浓度，验证10 μmol/L的诱导浓度下，细胞的形态变化较明显，且细胞毒性较小;而当浓度为15 μmol/L及以上时，加入诱导剂24 h内，部分细胞即出现皱缩，丧失贴壁状态，聚集成团脱落。因此实验组均选择10 μmol/L的诱导浓度。本课题的结果证实了5－Aza对于西藏小型猪MSCs的诱导分化能力。另外，亦有研究表明:部分未经化学诱导的MSCs经长期传代后，持续培养，生长至融合时亦可出现肌管样结构，因而认为MSCs具有长期传代增殖后，可自发出现肌源性转化的生物学生长特性，而非必然是诱导的结果［16］。因此本课题在设置空白对照组的同时，亦设置了相应的阴性对照组，并选择了第6代细胞进行诱导。实验结果表明，空白对照组的诱导阳性率与阴性对照组的诱导阳性率相比较，其差异无统计学意义，说明第6代MSCs持续培养28 d时，未出现明显的自发性肌源性转化。而5－Aza组的MSCs出现了部分细胞表达心肌细胞特异性抗原，说明5－Aza能够将小型猪MSCs诱导成为心肌样细胞。但是，对于所谓“心肌样细胞”的认定，如有条件，可行电镜观察细胞的超微结构，并进一步从分子生物学水平研究细胞表达的情况，并研究细胞的电生理活动情况及细胞之间的联系。

本课题选择CT－1作为一种有前途的诱导剂进行研究，并以5－Aza作为阳性对照，研究CT－1诱导西藏小型猪MSCs分化为心肌样细胞中的作用。CT－1说明书中以0.1 μg/L作为其毒性作用浓度的上限，因此在预实验中，我们设置了0.1 μg/L、0.05 μg/L、0.025 μg/L浓度组。在诱导作用1 d后，各组均未出现明显的细胞中毒及死亡情况。在连续培养28 d后，各组死亡及状态差的比例未观察到明显的差异。因此，在正式实验中，确定0.1 μg/L作为诱导浓度。在最终的诱导结果中，CT－1组的诱导率与空白对照组有显著差异，证实了0.1 μg/L的CT－1能够单独在体外诱导西藏小型猪MSCs转化为心肌样细胞，诱导后的细胞获得部分心肌细胞特异性蛋白(α－actin、cTnT)的表达。而在合用组中，CT－1(0.1 μg/L)与 5 － Aza(10 μmol/L)合用能够显著提高西藏小型猪MSCs转化为心肌样细胞的诱导率。CT－1能够将西藏小型猪MSCs诱导分化为心肌样细胞，其诱导率高于空白对照组(P＜0.05)，但低于5－Aza组(P＜0.01);而CT－1与5－Aza的合用诱导液诱导分化的效率与单独的5－Aza组比较，效率显著提高，其差异显著(P＜0.01)。因此我们认为CT－1和5－Aza均可以诱导MSCs向心肌样细胞分化，这为下一步用CT－1修饰MSCs移植治疗急性心肌梗死提供实验依据。

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