褪黑素对胃肠运动的影响*

陈春球， 丁卫星， 李永渝

(1同济大学附属第十人民医院胃肠外科，上海 200072;2同济大学医学院病理生理教研室，上海 200092)

褪黑素(melatonin)最先被发现是在松果体中合成并周期性分泌的，它作为内分泌激素之一调控机体的生物节律，主要参与对清醒和睡眠周期的调控。后来发现褪黑素亦参与了机体进食和消化功能的调节［1］。1995年在肠道中发现合成褪黑素的酶，认为褪黑素可在松果体外的肠道合成［2］。褪黑素在肠道内有旁分泌作用且具有连续性或周期性分泌。褪黑素对肠道功能的影响已有多方面的研究，但对于肠道动力调控及其机制并不明确。本研究通过检测不同浓度褪黑素对于结肠和全胃肠道运输能力的影响，以及褪黑素拮抗剂应用后的作用变化，初步探讨褪黑素对胃肠动力作用特点。

材料和方法

1 材料与试剂

雄性C57BL小鼠，体重20～25 g，由同济大学医学院动物实验室提供。褪黑素和luzindole购自Tocris。常规溶剂 DMSO和伊文斯蓝购自 Sigma－Aldrich。褪黑素和luzindole的溶剂和空白对照试剂均用3%DMSO。5% 伊文斯蓝+5% 阿拉伯树胶配成伊文斯蓝溶液。

2 结肠玻璃珠推排实验

用C57BL小鼠60只，禁食不禁水12 h，随机均分成5组，即对照组、不同剂量褪黑素组(1 mg/kg、5 mg/kg、50 mg/kg和75 mg/kg组)，异氟醚吸入麻醉下腹腔注射对照溶剂(3%DMSO)或不同剂量褪黑素，分别在注射15 min和45 min后，取每组鼠6只，用特制的硅胶棒，将预热(37℃)的玻璃珠1粒(直径2 mm)推入远端结肠20 mm，然后将小鼠单独置于干净笼中，记录玻璃珠排出时间。玻璃珠排出时间越短，说明药物对结肠运动的促进越强，反之则抑制结肠运动。如果超过30 min玻璃珠未能排出，断头处死小鼠并确定玻璃珠的位置和明确原因。

另用2组小鼠(6只/组)在注射大剂量褪黑素(75 mg/kg)或溶剂前15 min，腹腔内注射褪黑素拮抗剂luzindole(5 mg/kg)，在注射褪黑素15 min后同上处理，观测结肠玻璃珠的排推情况。另取2组小鼠为对照组，包括空白对照组和注射luzindole+溶剂对照组(6只/组)，后者主要用于观测褪黑素拮抗剂luzindole本身对结肠运动的可能影响。

3 全胃肠道运输实验

取C57BL小鼠30只，同上空腹处理后随机均分成5 组，腹腔内注射 1 mg/kg、5 mg/kg、25 mg/kg 和75 mg/kg褪黑素或对照溶剂15 min后，每只鼠灌胃1.5 mL预温(37℃)的伊文斯蓝试剂。将小鼠放回原各自笼中。记录从灌胃结束到第1颗蓝色粪粒排出的时间，作为全胃肠道运输时间。

4 统计学处理

结 果

1 腹腔内注射褪黑素15 min后结肠玻璃珠排推时间变化

在结肠玻璃珠排推实验中，腹腔内注射不同浓度褪黑素15 min后，褪黑素浓度为1 mg/kg时，结肠排出玻璃珠的时间缩短，与注射溶剂的对照组比较存在显著差异(P＜0.01);在浓度为5 mg/kg和50 mg/kg时，玻璃珠排出时间与对照组比较无显著差异;在褪黑素浓度为75 mg/kg时，结肠排出玻璃珠的时间延长，与对照组比较存在显著差异(P＜0.01)。结果表明用药15 min后，玻璃珠排出时间总的趋势是随着褪黑素浓度的增加，结肠动力由加快转为降低，见图1。

2 腹腔内注射褪黑素45 min后结肠玻璃珠排推时间变化

在腹腔内注射不同浓度褪黑素后45 min，结肠排推玻璃珠实验结果与用药15 min的有所不同:褪黑素浓度为5 mg/kg时，结肠排推时间缩短(P＜0.01);在1 mg/kg和50 mg/kg剂量时，与对照组比较并无显著差异;在75 mg/kg时，结果同上，玻璃珠排出时间延长，与对照组比较差异显著(P＜0.01)，见图2。

3 褪黑素拮抗剂在结肠玻璃珠排推实验中的作用

用褪黑素拮抗剂luzindole 5 mg/kg单独腹腔内注射，该药本身对结肠玻璃珠排出时间没有明显影响;但与褪黑素合用，能一定程度拮抗大剂量褪黑素(75 mg/kg)对结肠运动的抑制，玻璃珠排出时间明显缩短(P＜0.01)，见图3。

4 褪黑素对全胃肠道运输时间的作用

在全胃肠道运动实验中，腹腔内注射褪黑素1 mg/kg和5 mg/kg后全肠道运动加快，排出伊文斯蓝粪粒出现早，与溶剂对照组比较差异显著(均P＜0.01)。但当腹腔内注射大剂量褪黑素(75 mg/kg)时，肠道运动减慢，排出伊文斯蓝粪粒的时间明显延长(P ＜0.01)，见图4。

Figure 1.Changes of the expulsive time of colon beads after intraperitoneal injection of different concentrations of melatonin in mice at 15 min..n=6.＊＊P＜0.01 vs control.图1 腹腔内注射不同剂量褪黑素15 min后结肠玻璃珠排推时间的变化

Figure 2.Changes of the expulsive time of colon beads after intraperitoneal injection of different concentrations of melatonin in mice at 45 min..n=6.*P＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control.图2 腹腔内注射不同剂量褪黑素45 min后结肠玻璃珠排出时间的变化

讨 论

褪黑素(化学名为 N－acetyl－5－methoxytryptamine)被发现于1917年，后来在人类、动物、植物和微生物中被陆续发现。1974年褪黑素被发现存在于肠道的阑尾组织中。褪黑素是一种脂溶性物质，能快速通过各种生物膜，参与许多调节过程，如生物节律、肠道反射、抗炎、新陈代谢和生殖等。另外，褪黑素可能作为不同脏器之间信息交流的介质［3］。Bubenik等［4］最先报道褪黑素存在于肠道黏膜中，分别被免疫组化和放射免疫学方法所证实。在哺乳动物肠道，褪黑素的分布不一致，在结肠、直肠中含量最高，空肠和回肠最低。褪黑素为肠道中的嗜铬细胞合成，并且褪黑素的分布量与肠道内的嗜铬细胞分布密度相一致［5］。部分肠道，特别是低位肠道内褪黑素是由血液循环中的褪黑素积聚而来，表现为松果体源性褪黑素的储存容器。但肠道内褪黑素的浓度具有独立性，因为在切除松果体的大鼠其肠道内褪黑素的浓度并未受影响，在任何时间肠道内褪黑素浓度至少比血中浓度高400倍，且肠道内浓度与年龄有关［6］。限制饮食能增加小鼠肠道和大脑中的褪黑素浓度。这些发现表明褪黑素可能参与调节消化和进食的功能。

Figure 3.Changes of the expulsive time of colon beads after intraperitoneal injection of melatonin(75 mg/kg)and melatonin antagonist luzindole(5 mg/kg)in mice at 15 min..n=6.＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs luzindole+melatonin.图3 腹腔内注射褪黑素拮抗剂luzindole对大剂量褪黑素(75 mg/kg)延长结肠玻璃珠排出时间的影响

Figure 4.Changes of the gastrointestinal transit time after intraperitoneal injection of different concentrations of melatonin in mice(Evans blue test)..n=6.＊＊P＜0.01 vs control.图4 腹腔内注射不同剂量褪黑素后全胃肠道运输时间的变化

褪黑素受体存在于小肠和结肠中，褪黑素通过膜上特异受体激活生理功能。褪黑素受体包括MT1、MT2 和 MT3［7］。MT1 和 MT2 均为 G 蛋白偶联受体家族，具有7次跨膜结构，但它们的膜内通路完全不同［8］。Luzindole可拮抗 MT1和 MT2，MT2还有特异性拮抗剂4－P－PDOT，目前尚无单独的MT1拮抗剂。MT1 mRNA表达在十二指肠和低位的空回肠最高，并且表达没有周期节律性。在短期禁食后，大鼠小肠和结肠表皮下层MT1受体表达量增加，但长期禁食其表达量又会恢复正常。通过免疫化学方法发现，在大鼠MT2表达在肠道的黏膜肌层以及环形和纵行肌层中，提示 MT2参与调节肠道的动力［9］。MT3受体是一种酶，为醌还原酶2(quinone reductase 2，QR2)，能被哌唑嗪所拮抗，可能参与抗氧化的作用。

有研究报道，褪黑素可能参与调节肠道动力，肠道免疫，肠道分泌等［10］，但具体的作用机理并不明确。对肠道动力方面的研究发现，褪黑素能很快渗透通过黏膜层和黏膜下层，作用于黏膜肌层或肠道神经丛。褪黑素通过激活褪黑素受体调节肠道动力，在这过程中MT2受体最有可能参与［11］。有动物实验研究表明，褪黑素依赖于浓度的变化，兴奋或抑制肠道的动力。在予以小剂量褪黑素后，能加快大鼠肠道动力，缩短运输时间，但在大剂量时减慢肠道动力，并且这些作用均能为MT1和MT2受体阻滞剂luzindole阻断［12］。这与我们对小鼠的研究结果相一致:小剂量给予褪黑素，小鼠结肠的运动加快，排出玻璃珠的时间明显缩短，而用大剂量则减慢结肠运动，排出玻璃珠的时间明显延长。在对小鼠全胃肠运动实验中也得到相似结果。并且应用luzindole后能阻断大剂量褪黑素对结肠动力的抑制。

对褪黑素影响或调节胃肠运动的机制目前不清楚。体外研究发现，褪黑素能减少大鼠小肠和结肠的自发性收缩力，但肠道收缩频率并不改变。内、外源性褪黑素能抑制进食前后肠道运动的不规则波，认为可能与褪黑素作用于肠道神经元有关［13］。近来的研究认为，褪黑素可能作用于肠道5－HT(5－hydroxytryptamine)受体，抑制5－HT转送蛋白的活性，抑制肠上皮细胞对5－HT的再摄取［14］。有研究发现，外源性褪黑素能减轻大鼠肠炎的腹泻症状，但参与的机制并未能阐明［15］。本研究初步看到低浓度褪黑素促进小鼠胃肠运动、高浓度褪黑素则抑制其运动。然而，其中的机制是什么?这些作用是否有MT1和MT2的同时参与?它们如何调控胃肠道动力?这些问题有待下一步研究。

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