高脂环境对大鼠成肌细胞糖脂代谢的影响*

韩玲玲， 李 佳， 陈 颖， 王 威， 张 丹， 刘国良△

(1中国医科大学附属第一医院内分泌科，辽宁 沈阳 110001;2中国医科大学附属第四医院内分泌科，辽宁 沈阳 110032;3沈阳市93303部队医院，辽宁 沈阳 110043)

2型糖尿病发生的两个关键环节是胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能衰竭。研究表明，高游离脂肪酸血症是肥胖引发胰岛素抵抗的重要致病因素。游离脂肪酸抑制基础状态和胰岛素刺激后的组织摄取与利用葡萄糖，造成组织对胰岛素的敏感性降低。骨骼肌是机体葡萄糖、脂质摄取和利用的重要器官，因而骨骼肌的脂肪沉积与骨骼肌胰岛素抵抗的关系受到越来越多的关注［1，2］。本研究将给予原代培养的大鼠成肌细胞不同剂量棕榈酸(palmitic acid，PA)处理不同时间，通过检测细胞活力、甘油三酯在细胞中的沉积及含量，以及葡萄糖摄取的变化，以探讨棕榈酸造成大鼠成肌细胞的脂毒性，并进一步研究其对成肌细胞糖代谢的影响。

材料和方法

1 主要仪器与试剂

超净工作台(蚌埠净化设备厂)，CO2孵箱(Forma Scientific)，超高速离心机(Sanyo)，倒置相差显微镜(Nikon)，低温离心机(Sigma)，负压吸引器(Millipore)，酶标仪(Bio－Rad)，多功能液闪发光测定仪(Perkinelmer)。

PA(Sigma)，DMEM 和胎牛血清(HyClone)，胶原酶Ⅰ和牛血清白蛋白(Sigma)，油红O干粉(Solarbio)，兔抗大鼠α－肌动蛋白抗体、山羊抗兔多克隆抗体及过氧化物酶标记的链霉卵白素染色试剂盒(北京博奥森)，甘油三酯［甘油磷酸氧化酶－过氧化物酶(glycerophosphate oxidase－peroxidase，GPO －POD)法］测定试剂盒(北京普利莱)，［3H］标记－2－脱氧 －左旋 －葡萄糖(2－deoxy－D－［3H］glucose)(Perkinelmer)，其它试剂均为国产分析纯级。

2 方法

2.1 大鼠成肌细胞分离、培养、传代及鉴定 取Wistar乳鼠4只，在无菌条件下分离双下肢及腹部肌肉，剪成1 mm×1 mm×1 mm小块，I型胶原酶消化40 min后，0.25%胰蛋白酶消化30 min，过200 μm孔径的滤网，1000 r/min离心10 min，弃去上清液，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，以109cells/L的细胞密度接种于6孔板中，37℃、5%CO2条件下培养细胞。24 h后，胰酶消化，以2×109cells/L的细胞密度，重新接种于75 cm2的大培养瓶。以后每2－3 d换液1次。待细胞处于80% ～90%融合状态时，用含0.25%胰蛋白酶消化液消化传代，差速贴壁法纯化。将细胞接种于24孔板后，用兔抗大鼠α－肌动蛋白抗体对细胞进行免疫组织化学鉴定，见图1，成肌细胞α－肌动蛋白在胞浆内被染成黄色。

2.2 PA处理细胞及测定指标 原代培养细胞处于80% ～90%融合状态时用0.1、0.3、0.5 mmol/L PA处理6、12、24 h 后，用 MTT 法检测成肌细胞活力［3］;用油红O染色法检测成肌细胞脂肪变性后甘油三酯沉积［4］;用GPO－POD酶法测定成肌细胞脂肪变性后甘油三酯含量［5］;用同位素示踪法检测2－deoxy－D －［3H］glucose摄取［6］。

3 统计学处理

用SPSS 13.0软件进行数据处理，数据以均数±标准差()表示，采用单因素方差分析(One－way ANOVA)进行组间差异的显著性检验，两两比较用q检验(SNK)。

Figure 1.Rat myoblast immunohistochemistry staining revealed that the cultured cells were rat myoblasts(×200).The rat α－actin was stained as yellow in the cytoplasm of myoblasts.图1 大鼠成肌细胞的免疫组化鉴定

结 果

1 PA对成肌细胞活力的影响

如图2所示，随着 PA处理浓度(0.1～0.5 mmol/L)的增加及暴露时间(6～24 h)的延长，成肌细胞活力不断降低，并呈现剂量和时间依赖性的效应关系。0.1 mmol/L PA未对细胞活力产生明显影响，0.3 mmol/L PA暴露时间6、12 h亦未对细胞活力产生明显影响，但该剂量暴露24 h使细胞活力明显下降。0.5 mmol/L PA在3个暴露时点段均使细胞活力显著下降。

Figure 2.MTT method showed the effect of PA on the cell viability of myoblasts..n=6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control.图2 MTT法检测PA对成肌细胞活力的影响

2 PA对成肌细胞甘油三酯沉积的影响

油红O染色细胞质内出现橘红色的脂滴表示甘油三酯沉积。正常培养的细胞(未加PA)中未见甘油三酯沉积。如图3所示，随着PA暴露剂量和时间增加，甘油三酯沉积逐渐增加。但是各剂量PA组培养6 h，细胞内可见少量脂肪变性细胞，脂滴数量较少。除0.1 mmol/L PA培养12和24 h外，各组脂变细胞数量明显增多，细胞质内聚集了较多脂滴沉积，部分脂滴融合。

Figure 3.Oil red O dyeing method showed that palmitic acid induced TG sediment in myoblasts(×400).图3 油红O染色显示PA诱导大鼠成肌细胞甘油三酯沉积

3 PA对成肌细胞内甘油三酯含量的影响

如表1所示，与对照相比，甘油三酯含量随PA浓度增加、作用时间延长而增加。在0.3 mmol/L PA(12、24 h)组和 0.5 mmol/L PA(6、12、24 h)组有明显甘油三酯沉积。

表1 GPO－POD法测定大鼠成肌细胞中甘油三酯含量Table 1.GPO－POD method was used to determinate the triglyceride content in myoblasts(mmol/L..n=6)

表1 GPO－POD法测定大鼠成肌细胞中甘油三酯含量Table 1.GPO－POD method was used to determinate the triglyceride content in myoblasts(mmol/L..n=6)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control;##P ＜0.01 vs 0.1 mmol/L PA;△P＜0.05 ，△△P ＜0.01 vs 6 h.

Group 6 h 12 h 24 h Control 1.023 ±0.468 1.046 ±0.320 1.053 ±0.3970.1 mmol/L PA 1.183 ±0.370 1.687 ±0.623 1.951 ±0.748＊△0.3 mmol/L PA 1.317 ±0.329 3.277 ±0.503＊＊##△△ 3.955 ±0.836＊＊##△△0.5 mmol/L PA 2.547 ±0.493＊＊## 5.725 ±0.807＊＊##△△ 6.296 ±0.596＊＊##△△

4 PA对成肌细胞糖摄取的影响

如表2所示，与对照相比，随PA浓度升高、作用时间延长，大鼠成肌细胞糖摄取减低，但24和12 h无显著差异。0.1 mmol/L PA(24 h)组、0.3 mmol/L PA(12、24 h)组及0.5 mmol/L PA(12、24 h)组的大鼠成肌细胞糖摄取显著减低，见表2。

表2 同位素示踪法检测大鼠成肌细胞糖摄取情况Table 2.Isotope tracer method was used to detect the 2－deoxy－D－［3H］glucose uptake of rat myoblasts(10－2pmol/min..n=3)

表2 同位素示踪法检测大鼠成肌细胞糖摄取情况Table 2.Isotope tracer method was used to detect the 2－deoxy－D－［3H］glucose uptake of rat myoblasts(10－2pmol/min..n=3)

＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05 vs 0.1 mmol/L PA;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs 6 h.

Group 6 h 12 h 24 h Control 2.300 ±0.502 2.250 ±0.409 2.233 ±0.2940.1 mmol/L PA 2.267 ±0.468 1.950 ±0.362 1.683 ±0.264＊＊△0.3 mmol/L PA 2.183 ±0.349 1.583 ±0.534＊＊△ 1.417 ±0.299＊＊△△0.5 mmol/L PA 2.150 ±0.288 1.450 ±0.404＊＊△△ 1.183 ±0.397＊＊#△△

讨 论

近年的研究表明，血清游离脂肪酸升高和甘油三酯在非脂肪组织的异位沉积与这两个环节密切相关［7］。对糖尿病患者的非肥胖非糖尿病后代研究表明，肌细胞内脂质的增多可作为导致胰岛素抵抗发生的早期异常改变，并提示此异常改变可导致该个体葡萄糖摄取障碍［8］。骨骼肌是葡萄糖代谢的重要组织，骨骼肌的胰岛素敏感性降低是机体胰岛素抵抗的主要原因。骨骼肌脂质分布与含量异常，及骨骼肌异位脂肪的过多沉积，被认为是胰岛素抵抗的关键因素之一。

本实验提取3 d龄Wistar大鼠的成肌细胞，进行原代培养及鉴定后，应用有代表性的游离脂肪酸－不同浓度PA诱导大鼠成肌细胞脂肪变性。实验结果发现随着PA处理浓度和时间的增加，成肌细胞活力逐渐降低，甘油三酯沉积及细胞内含量逐渐增加，葡萄糖摄取逐渐降低。本研究表明，高游离脂肪酸血症是肥胖引发胰岛素抵抗的重要致病因素，游离脂肪酸抑制基础状态和胰岛素刺激后的组织摄取与葡萄糖利用，造成组织对胰岛素的敏感性降低，但是其抑制骨骼肌葡萄糖摄取的环节还有待进一步研究。有研究发现，骨骼肌组织内增多的脂肪将比葡萄糖优先利用，导致肌细胞利用葡萄糖能力下降，摄取葡萄糖减少，引起胰岛素抵抗。研究还发现，游离脂肪酸不只是单纯通过葡萄糖－脂肪酸循环与葡萄糖相互竞争，可能还通过其它机制影响葡萄糖代谢。近来研究发现，骨骼肌的脂质代谢异常与胰岛素抵抗以及糖尿病的发生发展密切相关。因而异位脂肪组织可以作为临床治疗的目标，通过不同的治疗方法，减少肥胖，延缓和防止胰岛素抵抗的发生、发展，以达到预防糖尿病和心血管疾病的目的。

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［3］周 华，杨 曦，张雅鸥，等.Ghrelin抑制小鼠骨髓基质细胞成脂分化［J］.基础医学与临床，2007，27(8):886－890.

［4］陈 萍，曾方银，张 鹏.甘油内空白法与GPO－POD法检测血清三酰甘油［J］.检验医学与临床，2007，4(4):261－263.

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