NF-κB在稳定期低体重慢性阻塞性肺病患者中的表达

齐 咏 马利军 牛红丽 程剑剑 吴纪珍 (河南省人民医院呼吸内科，河南 郑州 450003)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种慢性炎症过程，不仅影响肺，也可以引起显著的全身反应，包括体重下降、营养不良、骨骼肌功能障碍等。研究发现50%的重度以及10%～20%的轻、中度COPD患者存在无法解释的体重下降，部分极度消瘦，严重者甚至发生“肺恶病质综合征”，但其确切机制尚未阐明。本研究以稳定期COPD患者为观察对象，观察不同营养状况COPD患者外周血单核细胞核转录因子(NF)-κB和炎症因子表达情况，探讨COPD体重下降与系统炎症的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象 30例COPD患者为我院2007年12月至2009年12月门诊及住院患者，均符合我国2002年制定的《慢性阻塞性肺疾病(COPD)诊治指南》中COPD的诊断标准，临床属于稳定期，体重指数(BMI)＜18.5 kg/m2〔1〕。正常对照组30例，均来自门诊健康体检者。两组患者在性别、年龄方面差异无显著性，具有可比性。

1.2 方法 入选对象均进行详细的病史询问及体格检查。

1.3 血清肿瘤坏死因子(TNF)-α、白介素-8(IL-8)浓度的检测分离血清后采用ELISA法测定TNF-α、IL-8的含量。试剂为美国RB公司产品，操作按照说明书进行。

1.4 外周血NF-κB检测

1.4.1 密度梯度离心法分离单个核细胞 受试者均于上午8～9时空腹取肘静脉血6 ml，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液密度梯度离心法常规分离外周血单个核细胞(PBMCs)，将细胞调至1 ×106/ml。

1.4.2 提取核蛋白 分离出淡黄色层单核细胞，移入另一离心管，加入10 ml磷酸盐缓冲液(PBS)，离心3 000 r/min，5 min;吸除上清液，将洗过的细胞移至1.5 ml Ependorff管，再悬浮于1 ml PBS，在高速离心机中离心10 000 r/min×30 s;仔细吸除上清液，加入0.4 ml缓冲液A，放在冰上膨胀15 min;加入25 μl 10%壬基酸聚氧乙烯醚(NP-40)，强涡处理10 s，离心12 000 r/min ×30 s;吸除上清液，加缓冲液 B 200 μl，4℃ 强烈振荡15 min;4℃离心10 000 r/min×5 min，上清液即为核蛋白，每份样品分装5个1 ml EP管中，-70℃贮存备用。

1.4.3 NF-κB活性水平检测 NF-κB试剂盒购于美国RB公司，按试剂盒说明书操作。用 ELISA法检测 NF-κB在波长595 nm处的吸光度值(OD值)。根据标准品绘制浓度曲线，再根据OD值在标准曲线上查出NF-κB活性水平。

1.5 统计学分析 应用SPSS14.0软件包处理，数据采用±s表示，所用统计分析方法为成组t检验及直线相关分析。

2 结果

2.1 NF-κB含量在各组之间的变化 COPD组经LPS刺激后NF-κB活性水平为(720.41±265.62)pg/ml，高于未经 LPS刺激组〔(457.14±227.95)pg/ml，P ＞0.05〕，但无统计学意义。对照组经 LPS刺激后 NF-κB活性水平为(252.82±74.23)pg/ml，高于未经 LPS 刺激组〔(87.22 ± 33.41)pg/ml，P ＜0.05〕。

2.2 TNF-α、IL-8在COPD组和对照组血清中的浓度变化COPD组血清TNF-α、IL-8的浓度均较对照组显著增高(P＜0.05)。见表1。

表1 不同组血清TNF-α、IL-8浓度比较(±s，pg/ml)

表1 不同组血清TNF-α、IL-8浓度比较(±s，pg/ml)

IL-8 COPD组组别 n TNF-α 30 60.41±13.04 45.23±4.03正常组 30 23.20±5.83 18.82±5.14 P值 ＜0.000 15 ＜0.000 15

2.3 COPD组NF-κB的表达与血清 TNF-α、IL-8浓度的相关性 COPD组NF-κB与IL-8之间存在明显正相关(r=0.763，P ＜0.001)，与 TNF-α 也存在正相关(r=0.407，P ＜0.05)。

2.4 COPD组炎性介质与BMI的相关关系 TNF-α与BMI呈显著负相关(r=-0.433，P ＜0.05)。IL-8、NF-κB 与 BMI存在负相关趋势，但无统计学意义(r=-0.074，-0.314，均P＞0.05)。

2.5 COPD组与对照组BMI比较 BMI水平在COPD组为(16.21±2.04)kg/m2，对照组为(24.59 ±3.11)kg/m2，组间比较差异显著(P=0.000 67)。

3 讨论

COPD不仅表现为肺部的局部炎症，也表现为一种轻度的全身炎症反应〔2〕。目前对这种全身炎症反应尚无公认的定义，但大多数文献把其定义为炎症级联反应中部分炎症细胞和/或炎症介质等在血液循环中的增高，包括中性粒细胞及巨噬细胞增多、淋巴细胞中细胞色素氧化酶活性增高、单核细胞MMP-9增高以及IL-6、IL-8、TNF-α、CRP等增高。大多数炎症细胞和炎症介质通过复杂的网络发挥作用，细胞与介质稳态的破坏可以引起系统的慢性炎症病理改变。Fabbri等〔2〕认为应称其为慢性全身炎症反应综合征，可能更能说明COPD全身炎症的危害。本实验显示，低体重COPD患者稳定期血清TNF-α、IL-8的浓度较正常对照组显著增高。说明低体重COPD患者在稳定期存在全身炎症反应。

NF-κB是Sen等于1986年首次从小鼠B细胞核提取物中发现的一种能与免疫球蛋白κ轻链基因的增强子κB序列特异结合的蛋白因子，激活NF-κB已成为肺部炎症性疾病的一个重要特征。本实验结果显示，COPD组经LPS刺激的血样NF-κB含量高于未经LPS刺激的正常组，提示COPD患者在稳定期存在全身炎症反应，体内炎性因子含量较正常对照组高，与以往的研究结果一致〔3〕。本实验发现 NF-κB与TNF-α、IL-8的含量呈显著正相关。NF-κB介导多种炎症因子基因的转录，而TNF-α、IL-8则又成为 NF-κB的激活剂，从而形成了 NF-κB与炎症因子间的正反馈效应。有研究发现NF-κB可以诱导急性期反应蛋白如C3、C4、血清淀粉酶、诱导型NO合成酶(iNOS)、环氧合酶(COX-2)等炎性酶的产生，说明NF-κB除诱导炎性基因的表达外，还导致凝血-纤溶、激肽、补体和花生四烯酸等四大系统的相互激活，产生过度炎症反应。它们互相促进，加速局部炎症的发生发展，使肺脏反复损伤与修复、引起肺脏纤维化的发生，最终导致气道结构的重塑和气流阻塞，严重影响肺脏功能。

营养不良已被认为是COPD患者预后不良的独立、可逆的一个标志。BMI是营养参数中一个重要指标，本实验对低体重COPD患者NF-κB含量、血清炎症因子含量与BMI进行直线相关分析。发现COPD患者血清TNF-α含量与BMI呈显著负相关(r=-0.433)。体外实验证明注射重组IL-6、IL-1、TNF-α可导致健康动物厌食、体重减轻和恶病质。Avram等发现一种高效蛋白降解途径即泛素-蛋白酶体途径，这个途径主要作用是对细胞内的蛋白质进行降解，而这种降解活动依靠NF-κB来转换，有活性的核因子进入细胞核并和DNA上的启动区域结合，调整泛素蛋白酶体，最后交互作用减少肌肉蛋白的合成。

综上所述，稳定期低体重COPD患者存在全身炎症反应，NF-κB介导多种炎症因子基因的转录，炎性因子表达可能与COPD患者体质量下降有关。

1 中国肥胖问题工作组数据汇总分析协作组.我国成人体重指数和腰围对相关疾病危险因素异常的预测价值:适宜体重指数和腰围切点的研究〔J〕.中华流行病学杂志，2002;23(1):5-10.

2 Fabbri LM，Rabe KF.From COPD to chronic systemic inflammatory syndrome〔J〕.Lancet，2007，370(9589):797-9.

3 齐 咏，杨 岚，于维霞，等.氧化抗氧化失衡对慢性阻塞性肺疾病患者诱导痰巨噬细胞NF-κB活性的影响〔J〕.中国老年学杂志，2004;24(12):1142-4.