甘草酸对氧化应激、细胞凋亡的影响及其对糖尿病肾病大鼠的疗效

刘长山 王秀军 孙丽萍 柳 林 明 义 刘海霞 (潍坊市人民医院内分泌科，山东 潍坊 261041)

糖尿病肾病(DN)的发生、发展和严重程度与高血糖升高程度及持续时间密切相关〔1〕，高血糖导致的氧化应激是DN的重要发病机制。近年来许多研究发现细胞凋亡参与了DN发生的整个过程，但氧化应激与细胞凋亡的关系研究资料不多。本研究对糖尿病大鼠模型测定组织丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)，观察肾脏细胞凋亡形态学改变及凋亡相关蛋白的表达，并予以抗氧化剂α-硫辛酸和具有抗氧化作用的中药甘草酸进行干预治疗，以研究氧化应激与细胞凋亡的关系，探讨抗氧化剂防止细胞凋亡进而防治DN可能性。

1 材料与方法

1.1 实验材料 健康雄性6周龄Wistar大鼠，体重180～200 g，由山东大学实验动物中心提供。链脲佐菌素(STZ)购自美国 Alexi公司。α-硫辛酸购自德国史达德药厂(批号:81526)。甘草酸购自南京正大天晴制药有限公司(批号:国药准字H20051942)。DL-甘油醛购自美国Sigma公司。NADPH购自美国Roche公司。bcl-2、bax免疫组化测定药盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。H-7500透射电镜，日本HITACHI公司。UV-260型分光光度计，日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 分组及给药 适应性喂养大鼠1 w后，随机取10只作为正常对照组喂养常规饲料，其余30只拟作为糖尿病观察组。于左下腹腔按60 mg/kg体重注射STZ溶液，注射后72 h断尾用罗氏血糖仪测血糖，血糖≥16.7 mmol/L为糖尿病模型建立。将30只模型大鼠随机分为糖尿病模型组、α-硫辛酸治疗组和甘草酸治疗组，每组10只，各组间血糖值无差异。每日灌胃给药，α-硫辛酸组 10 mg·kg－1·d－1，甘草酸组 30 mg·kg－1·d－1，糖尿病模型组和正常对照组则用等容量生理盐水1 ml/100 g/d。于实验的第 4，8，12，16 周测定血糖，16 w 时处死大鼠。期间大鼠死亡1只，共有39只大鼠完成全部实验研究。用10%水合氯醛按400 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠。取右肾组织放于4%中性甲醛中固定，进行HE染色及免疫组化染色。取左肾少量皮质，切成约1 cm3左右小块，放入3%戊二醛固定，进行电镜观察。取左肾剩余皮质称重，置于-70℃冰箱保存，进行丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)测定。肾脏病理观察采用常规HE染色。

1.2.2 bcl-2、bax蛋白免疫组织化学染色 常规石蜡切片，透明、复水，按1∶100比例稀释的小鼠抗大鼠bax和bcl-2抗体，滴加生物素化羊抗小鼠IgG二抗工作液，加辣根过氧化物酶标记的卵白素工作液，DAB显色。

1.2.3 肾组织透射电镜超微结构观察 将组织切成1 mm3左右的小块，用3%戊二醛固定。1%锇酸后固定，Epon812包埋。在透射电镜下观察。

2 结果

2.1 实验前后大鼠体重与血糖变化 药物干预试验前各糖尿病大鼠体重与正常对照组均无明显差异(P＞0.05)，血糖均显著高于正常对照组(P＜0.01)，治疗16 w结束时，糖尿病各组大鼠体重明显低于正常对照组(P＜0.01)，两治疗组血糖与治疗前比较无显著差异(P＞0.05)，糖尿病各组间体重无明显差异(P＞0.05)。见表1。

表1 各组大鼠体重和血糖比较(±s)

表1 各组大鼠体重和血糖比较(±s)

与正常对照组比较:1)P＜0.01

组别 n 体重(g)实验前 实验16 w后血糖(mmol/L)实验前 实验16 w后正常对照组 10 272.2±12.3 505.4±55.6 7.13±1.02 7.52±0.90糖尿病模型组 9 272.8±14.5 315.5±24.31)21.39±8.281)22.66±7.43 α-硫辛酸组 10 274.7±11.1 297.1±24.21)21.68±7.591)23.37±8.38甘草酸组 10 274.6±10.9 298.0±25.41)21.12±7.461)23.12±8.01

2.2 α-硫辛酸、甘草酸对糖尿病大鼠肾脏MDA、SOD的影响

与正常对照组比较，糖尿病各组大鼠肾组织匀浆MDA水平显著升高(P＜0.01)，SOD降低(P＜0.01);α-硫辛酸治疗组、甘草酸治疗组与糖尿病模型组比较，MDA水平降低(P＜0.05)，SOD升高(P＜0.01)，两治疗组间无显著性差异(P＞0.05)。见表2。

表2 大鼠肾脏丙二醛、超氧化物歧化酶水平比较(±s)

表2 大鼠肾脏丙二醛、超氧化物歧化酶水平比较(±s)

与正常对照组比较:1)P＜0.01;与糖尿病模型组比较:2)P＜0.05，3)P＜0.01

组别 n SOD(nU/mg) MDA(nmol/mg prot)正常对照组10 5.66±44.94 2.66±0.61糖尿病模型组 9 4.69±26.231) 4.30±0.391)α-硫辛酸治疗组 10 5.38±21.741)3) 3.08±0.281)2)甘草酸治疗组 10 5.25±18.731)3) 2.99±0.201)2)

2.3 肾脏病理学观察 光镜下见正常对照组大鼠肾小球毛细血管形态及分布无异常，糖尿病模型组见肾小球毛细血管充血、扩张，肾小球明显增大，肾小球系膜区扩张和基膜不同程度增厚，肾小球细胞数目减少，肾小球细胞外基质明显增多，系膜区扩大。而各糖尿病治疗组肾小球增大不明显，肾小球系膜细胞和系膜基质轻度增生，较糖尿病模型组病变明显减轻。

2.4 bcl-2蛋白表达结果 bcl-2蛋白主要位于肾小管，在细胞质和细胞膜表达。正常对照组大鼠肾脏bcl-2蛋白明显表达，糖尿病模型组肾小管bcl-2蛋白表达减少，而两糖尿病治疗组Bcl-2蛋白表达较糖尿病模型组组增多。

2.5 bax蛋白表达结果 bax蛋白在肾小球、肾小管均有表达，表达在胞浆内。正常对照组表达较弱，糖尿病模型组蛋白表达明显增多，而治疗组蛋白表达较糖尿病模型组减少。

2.6 透射电子显微镜细胞凋亡观察 电镜下可见正常大鼠肾小管上皮细胞有微绒毛，细胞胞膜完整，细胞器丰富，基底膜质膜内褶，线粒体良好，无线粒体肿胀。糖尿病模型组大鼠肾组织系膜细胞核内染色质趋边浓缩、聚集、细胞核周间隙增宽，线粒体明显肿胀，细胞质吞饮泡大量增多，上皮细胞内见凋亡小体。肾小管上皮细胞核固缩，核染色质边集。糖尿病治疗组大鼠肾组织细胞核固缩、染色质趋边减轻线粒体肿胀不明显。

3 讨论

细胞凋亡在DN的发生与发展中起着重要作用，糖尿病高血糖状态下的代谢紊乱使细胞凋亡增加是发生DN的重要原因，多种病理类型肾病的发生发展及损伤后的修复过程均伴随着细胞凋亡参与〔2〕。

高血糖通过何种途径导致细胞凋亡的机制尚不完全清楚，有研究提示，高血糖导致氧化应激与细胞凋亡密切相关，当外源性活性氧及细胞内ROS生成增加、清除ROS能力下降和抗氧化能力减弱时可致细胞凋亡，机制:活性氧诱导NF-κB表达;氧化应激诱导的与凋亡相关的基因除了与bcl-2有关外，c-Myc和Fas-FasL也参与氧化应激诱导的细胞凋亡〔3，4〕。

本实验中我们发现，糖尿病时，高血糖通过增加肾脏氧化应激而调节凋亡相关基因bcl-2和bax的表达，诱导肾小管、肾小球细胞凋亡而参与DN的发生发展。抗氧化治疗对DN的病理损害有明显的保护作用。

甘草酸是甘草中的主要活性成分，为甘草甜素类化合物，具有广泛的生理及药理作用，如抗炎症、免疫抑制、抗氧化、抑制血小板聚集，降血脂与抗动脉粥样硬化等〔5〕。本研究发现甘草酸具有明显抗氧化的作用，其作用效果与典型抗氧化剂α-硫辛酸相近，可改善DN动物模型肾脏病理变化及细胞凋亡，可见，中药甘草酸在防治DN中有较好的临床应用前景。

1 DCCT:TheDiabetesControland ComplicationsTrialResearch Group.The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus〔J〕.N Engl J Med，1993;329(14):977-86.

2 Sano K，Fujigaki Y，Miyaji T，et al.Role of apoptosis in uranyl acetateinduced acute renal failure and acquired resistance to uranyl acetate〔J〕.Kidney Int.2000;57(4):1560-70.

3 Collins M，Rivas A.The control of apoptosis in mammalian cells〔J〕.Trends Biochem Sci，1993;18(8):307-9.

4 Kamimoto Y，Sugiyama T，Kihira T，et al.Transgenic mice overproducing human thioredoxin-1，an antioxidative and anti-apoptotic protein，prevents diabetic embryopathy〔J〕.Diabetologia，2010;53(9):2046-55.

5 李开龙，张建国，王慧民，等.甘草酸18α体对梗阻性肾病大鼠肾间质中NF-κB表达的影响〔J〕.细胞与分子免疫学杂志，2004;20(1):31-3.