雷公藤内酯醇对β-淀粉样蛋白诱导的大鼠小胶质细胞IL-1β和PGE2表达的影响

李耀斌 聂 菁 吕 诚 胡小令 薛国勇 鲁纯纠 (南昌大学医学院解剖学教研室，江西 南昌 330006)

多数学者认为阿尔茨海默病 (AD)与 β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积激活小胶质细胞引起的炎症反应和神经毒性作用有关。激活的小胶质细胞分泌多种炎性介质参与AD病理过程，其中白细胞介素-1β(IL-1β)和前列腺素E2(PGE2)在这一过程起重要作用〔1～3〕。雷公藤内酯醇是雷公藤中的主要有效成分之一，具有显著的抗炎、免疫调节作用，可通过抑制免疫细胞中炎性因子的表达而发挥其药理作用〔4〕。故本实验拟用Aβ1-40诱导体外培养的原代小胶质细胞，建立AD细胞模型，并在此基础上给予不同剂量中药免疫抑制剂雷公藤内酯醇进行干预，观察药物对IL-1β和PGE2表达的影响，探讨雷公藤对AD的可能作用机制，为临床寻找防治AD的有效中药提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 新生24 h SD大鼠，购自江西中医学院实验动物中心。

1.1.2 试剂 DMEM/F12(1∶1)培养基、特优级新生小牛血清、胰蛋白酶均为Invitrogen公司产品;胎牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产品;盐酸利多卡因 (10 ml注射液，有效含量0.2 g，分子量288.82);雷公藤内酯醇、Aβ1-40均为Sigma公司产品;小鼠抗CD11b/c抗体 (CBL1512Z克隆号OX-42)为美国Chemicon International公司产品，人P物质(SP)免疫组织化学试剂盒、二氨基联苯胺 (DAB)显色试剂盒和多聚L-赖氨酸为北京中杉公司产品;IL-1β、PGE2放射免疫试剂盒均为北京华英公司产品。

1.2 方法

1.2.1 小胶质细胞纯化培养 按已有的小胶质细胞原代培养方法〔5〕，采取24 h内出生的SD乳鼠无菌条件下开颅取脑，仔细剥离血管和软脑膜，磷酸盐缓冲液 (PBS，0.01 mol/L)冲洗数次后剪碎，过200目细胞筛后离心弃上清，培养9 d左右，细胞充分分层生长后，加入盐酸利多卡因溶液(12 mmol/L)，37℃ 5%CO2培养箱中培养5 min，轻摇培养板2 min，镜下观察，待大量细胞悬浮后，收集细胞悬液，离心 (1 000 r/min 5 min)收集细胞，种植于6孔培养板，30 min后换液1次，去除未贴壁的细胞。加入含10%胎牛血清的DMEM/F12(1∶1)培养基继续培养。2～3 d换液1次，6 d后采用免疫细胞化学染色对小胶质细胞进行鉴定。

1.2.2 免疫细胞化学染色 取出培养中的盖玻片，经0.01 mol/L PBS洗涤细胞3次，4%多聚甲醛室温固定30 min，PBS洗涤细胞5 min 3次，3%H2O2去离子水孵育5～10 min，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min，滴加封闭用正常山羊血清工作液室温孵育5 min，倾去，勿洗，滴加一抗CD11b/c(1∶100)，4℃ 过夜;PBS冲洗3 min 3次;滴加生物素标记山羊抗小鼠IgG二抗工作液37℃ 10～15 min，PBS冲洗3 min×3次，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液 37℃ 10～15 min，PBS冲洗，3 min×3次，DAB显色剂显色，脱水，透明，封片，镜下观察摄片。以PBS(0.01 mol/L)缓冲液代替一抗做阴性对照。

1.2.3 Aβ1-40制备 将Aβ1-40溶于灭菌后的生理盐水，37℃孵育7 d，使其变成凝聚态的Aβ1-40液备用。

1.2.4 细胞分组与药物干预 小胶质细胞按1×105/cm2细胞密度接种于24孔培养板 (预先放置多聚赖氨酸处理过的盖玻片，每孔0.5 ml)分为4组 (每组8孔):5 μg/ml组加入终浓度为20 μg/ml的Aβ1-40和终浓度为5 μg/ml的雷公藤内酯醇，25 μg/ml组加入终浓度为 20 μg/ml的 Aβ1-40和终浓度为25 μg/ml的雷公藤内酯醇，模型组加入终浓度为20 μg/ml的Aβ1-40，对照组不处理。

1.2.5 IL-1β和 PGE2含量的检测 各组细胞培养2、12、24 h后取上清于－20℃冻存;细胞培养上清液参照产品说明书用放射免疫法检测IL-1β和PGE2的含量。

1.3 统计学处理 应用SPSS10.0统计软件进行分析，数据资料以±s表示，采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 Aβ1-40可诱导大鼠小胶质细胞IL-1β及PGE2表达上调20 μg/ml的Aβ1-40与大鼠小胶质细胞共孵育2、12、24 h后，分别提取细胞上清液，用放射免疫学的方法检测IL-1β及PGE2的含量。Aβ1-40可以诱导小胶质细胞IL-1β表达明显上调，而且在12 h达到高峰，上调率达44.9%，与对照组相比较有显著性差异 (P＜0.01);在24 h后逐渐降低，上调率仍可达18.7%，与对照组比较仍有显著性差异 (P＜0.05)。Aβ1-40在12 h可以诱导小胶质细胞PGE2表达明显上调，上调率达19%，与对照组相比较有显著性差异 (P＜0.01)。见图1。

图1 不同Aβ1-40与大鼠小胶质细胞共孵育时间下Aβ1-40对小胶质细胞IL-1β、PGE2表达的影响

2.2 雷公藤内酯醇可抑制Aβ1-40诱导的小胶质细胞IL-1β、PGE2表达 用 5、25 μg/ml的雷公藤内酯醇、20 μg/ml的Aβ1-40与大鼠小胶质细胞共孵育2、12、24 h后，分别提取细胞上清液，用放射免疫学的方法检测IL-1β、PGE2含量。当加入雷公藤内酯醇后可以抑制其 IL-1β的表达上调，尤其是在25 μg/ml、12 h 作用最强，IL-1β 表达下调了 36.6%，与模型组比较有显著性差异(P＜0.01)。5 μg/ml的雷公藤内酯醇在12 h可以抑制其PGE2的表达上调，PGE2表达下调了17.3%，与模型组相比较差异有统计学意义(P＜0.01)。见表1。

表1 不同浓度的雷公藤内酯醇对细胞上清液中IL-1β、PGE2表达的影响(± s，n=8)

表1 不同浓度的雷公藤内酯醇对细胞上清液中IL-1β、PGE2表达的影响(± s，n=8)

与对照组比较:1)P ＜0.05，2)P ＜0.01;与模型组比较:3)P ＜0.01，4)P ＜0.01;与5 μg/ml组比较:5)P ＜0.05，6)P ＜0.01

组别 IL-1β 2 h 12 h 24 h PGE2 2 h 12 h 24 h对照组 0.409 00±0.052 12 0.430 67±0.017 04 0.514 67±0.049 03 20.319±1.216 16.656±0.619 17.558±1.358模型组 0.538 67±0.024 832)0.624 00±0.007 002)0.611 00±0.076 181) 18.057±1.0361) 19.875±1.8112) 15.958±0.069 5 μg/ml组 0.599 00±0.010 152)0.485 67±0.062 853)0.273 00±0.041 152)3) 19.885±0.462 16.434±2.3944) 16.899±0.204 25 μg/ml组 0.554 00±0.057 302)0.395 33±0.091 743)5)0.447 00±0.010 03)6)17.331±1.8842)5) 19.594±1.5971)6) 18.176±0.1723)

3 讨论

McGeer等〔6〕根据病理学、流行病学调查资料首先提出了AD的免疫炎症学说，Aβ沉积激活小胶质细胞是其核心病理机制。近年来，该学说在AD发病中的作用已经被广泛重视。一般认为Aβ刺激小胶质细胞产生IL-1β是炎症反应的始动环节，IL-1β通过自分泌途径促进小胶质细胞的增殖和活化，启动IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和IL-1等细胞因子的释放，诱导补体、趋化因子和黏附分子的产生增加。这些免疫炎性因子反过来又激活小胶质细胞，在体内形成正反馈环路，产生炎症反应的级联放大效应，最终导致神经细胞变性坏死〔7〕。PG是花生四烯酸的代谢产物之一，普遍存在于体内各组织中。PGE2作为其中一个主要的炎症介导因子，不仅具有多种生理功能，而且在AD的炎性病理过程中也起到了重要的作用〔8〕，PGE2可刺激离体的重组人促红素 (CHO细胞)Aβ的表达上调，其机制可能是通过激活PGE2受体进而提高细胞水平上的 cAMP来实现的〔9，10〕。去除 PGE2受体，可以减少AD模型鼠中的氧化刺激炎性反应以及老年斑中Aβ的沉积〔11〕。以上提示PGE2在AD的发生发展中起重要的作用，但是其作用的具体机制尚存在争议，这可能与PGE2的受体存在着四个亚型，而各亚型在信号转导、组织定位和表达调控各有差异有关〔8〕。另外，流行病学的调查发现在脑脊液中PGE2含量高的患者中仅有轻度的记忆障碍，但在低PGE2含量的患者中症状却更为严重〔12〕。本实验在细胞水平上证实了Aβ在12 h可以激活小胶质细胞IL-1β和PGE2的表达到高峰，进一步支持了AD的免疫炎症学说。

雷公藤内酯醇是从雷公藤中分离出的活性最高的环氧化二萜内酯化合物，有较强的抗炎及免疫抑制活性，在临床上已得到广泛应用。本文前期工作表明，雷公藤内酯醇可以抑制Aβ诱导的AD动物模型海马核因子-κB的活化和IL-1β的表达，改善其学习记忆能力〔13，14〕。本实验进一步观察雷公藤内酯醇对Aβ诱导的AD细胞模型炎性介质表达的影响，结果显示，加药的两组小胶质细胞IL-1β和PGE2的表达在12 h较模型组明显降低，表明雷公藤内酯醇能抑制AD细胞模型IL-1β和PGE2的表达。因此认为，雷公藤内酯醇有可能通过抑制Aβ介导的小胶质细胞活化，减少细胞因子等炎症介质的分泌，从而减轻炎性反应，达到减轻神经元损伤、改善大鼠学习记忆能力的目的。但对于其确切的作用机制尚需进一步探讨。

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