TIZ基因mRNA在卵巢癌细胞系中的表达及其RNA干扰载体构建

赵冰冰 张 玮 李 力 阳志军

2002年，Shin等［1］应用酵母双杂交系统和谷胱甘肽转移酶(glutathione transferase，GST)融合蛋白技术发现了一种C2H2型锌指蛋白，该蛋白可以与肿瘤坏死因子相关因子-6(tumor necrosis factor receptor-associated factor-6，TRAF-6)结合并对TRAF-6起抑制作用，因此将此锌指蛋白命名为TIZ(TRAF-6 inhibitory znic finger protein)。本课题组前期研究发现TIZ蛋白在卵巢癌血清中表达率较卵巢良性患者和正常卵巢患者高，有可能作为卵巢癌诊断的标志物［2］，但对于TIZ基因与卵巢癌的关系知之甚少。因此，本实验采用RT-PCR方法检测不同卵巢癌细胞株TIZ基因mRNA的表达水平，设计并筛选干扰效率较高的siRNA干扰片段构建RNAi载体，为进一步研究TIZ基因对卵巢癌细胞生物学功能的影响打下了基础。

1 材料和方法

1.1 材料

卵巢上皮癌铂类敏感细胞系A2780、SKOV3和卵巢上皮癌铂类耐药细胞系A2780/DDP、A2780/CBP、SKOV3/DDP和 SKOV3/CBP(均为本试验室保存)［2］。Taq 酶购自 TAKARA 公司，Syber Green I购自上海捷瑞公司，质粒提取试剂盒购自三博远志公司。pTG19-T载体克隆载体购自上海捷瑞公司，pGPU6/GFP/Neo干扰载体购自吉玛公司，LipofectamineTM2000购自 Invitrogen公司，Biospin Gel Extraction Kit胶回收试剂盒由Bioflux公司提供，DH-5α菌株为本试验室保存。

1.2 实验方法

1.2.1 不同卵巢癌细胞系中TIZ基因表达的测定采用RT-PCR方法。引物设计:根据人类TIZ基因的mRNA序列设计RT-PCR引物，TIZ基因引物序列如下:TIZ基因上游引物:5'-CTGCCACATTCTTTACATTTG-3，下游引物:5'-GTTGCACAAGGGAGGTTAT-3，引物扩增片段为213bp。内参基因β-actin上游引物:5'-GATGACCCAGATCATGTTTG-3，下游引物 antisense:5'-TGGAGTTGAAGGTAGTTTCG-3，引物扩增片段为491bp，引物均由上海生物公司合成。细胞RNA提取采用Trizol一步法提取卵巢组织RNA，cDNA的合成采用RT逆转录试剂盒(TOYOBO公司提供，MMLV逆转录酶由Promega公司提供)，实验操作按说明书进行。PCR反应条件:预变性94℃ 5min，变性94℃ 30s，复性57℃ 30s、延伸72℃ 30s，进行 32 个循环后进一步延伸72℃ 10min。取10μl PCR产物于1.5%的琼脂糖凝胶电泳。

1.2.2 siRNA的设计与合成 根据Genebank上TIZ基因的mRNA序列设计5对siRNA并送上海吉玛公司合成，其序列如下:

1.2.3 TIZ-siRNA干扰片段细胞内介导 采用脂质体方法。选择对数生长期的细胞进行胰酶消化、吹打均匀和细胞计数，每个10cm2的培养瓶中种入约400 000个细胞，加入不含抗生素的1640培养液，于5%CO2、37℃培养箱培养24h;显微镜下观察细胞铺满率达到80%～90%，即进行转染;按每瓶 24μl(4.0μg)的DNA加入无抗生素、无血清1640培养基226μl，经混匀后室温孵育5min;按每瓶10μl Lipofectin TM2000 1640培养基240μl经混匀后室温孵育5min;将上述经过孵育的两种不同混合液混合后室温孵育20min，将混合液加到细胞中;培养6h后弃混合液，加入含双倍血清的1640培养基，5%CO2、37℃培养箱培养24h;24h后更换正常的培养基，继续培养24～48h进行后续实验。

1.2.4 TIZ和β-actint mRNA表达标准品的制备 TIZ和 β-actint mRNA表达标准品制备采用pTG19-T重组质粒。TIZ和β-actint mRNA表达PCR反应体系和反应条件同前。PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳后凝胶成像分析系统观察。PCR产物采用为Bioflux公司提供的Biospin Gel Extraction Kit胶回收试剂盒回收纯化，并与pTG19-T质粒载体连接，16℃反应过夜后将连接产物转化至大肠杆菌DH-5α制备的感受态，从37℃培养16～20h的DH-5α含氨苄抗性平皿中挑取阳性克隆，单克隆在LB培养液中37℃震荡培养16～20h后进行质粒DNA的快速提取，PCR鉴定重组质粒送生音公司测序，并在NCBI进行BLAST结果序列对比分析，显示与TIZ和β-actint基因的同源性达到100%。阳性标准品的制备，采用分光光度计进行重组基因质粒cDNA浓度测定并换算为拷贝浓度(copies/μl)，制备拷贝数依次相差10倍的标准品，即 109、108、107、106、105、104、103个/μl等。

1.2.5 TIZ-siRNA干扰片段细胞内介导前后细胞系TIZ mRNA表达的测定 采用实时荧光定量PCR法(QRT-PCR)。将5种siRNA干扰片段转染SKOV3细胞后48h提取细胞总mRNA、逆转录成cDNA，分别进行QRT-PCR扩增。采用8连管平行建立QRT-PCR反应体系，实验设细胞样品扩增目的基因TIZ和βactint各3管，同时标准品扩增目的基因TIZ和β-actint各2管和每空白对照(不含模板的反应体系)各1管，3组在荧光定量PCR仪上同时进行扩增。反应体系同前，反应条件:95℃预变性 2min，95℃ 30s，56℃30s，72℃ 40s，共 40 个循环，读板 2sec，72℃ 10min，4℃保存。PCR扩增产物定量PCR仪自行数据分析，给出各个样品的Ct值与SQ值(starting quantitiy)。结果判断:以质粒标准品的拷贝数对数为横坐标，以Ct值为纵坐标，建立标准曲线，根据样品的Ct值，读取标准曲线中对应的起始拷贝数，以此对每个样品cDNA进行定量分析。定量结果以SQ值表示。为了消除每个样品反应时cDNA量的不同，根据公式F:TIZ基因平均SQ值/β-actint基因平均SQ值来进行校正，并获得到各细胞TIZ基因的相对表达量。根据公式:基因沉寞率=(1-实验组/对照组)×100%，计算出各细胞TIZ基因沉寞率，以选择干扰效率最高的siRNA片段构建shRNA载体。

1.2.6 TIZsiRNA重组表达载体的构建 采用pGPU6/GFP/Neo载体，将其酶切。并用1.0%低熔点琼脂糖进行电泳。利用胶回收试剂盒回收酶切产物。采用T4 DNA连结酶将纯化后载体与退火的TIZ-573 siRNA、阳性和阴性进行对照siRNA双链插入片段进行连接。并将含有αsiRNA片段质粒的DNA转化感受态大肠杆菌TOP10后，37℃恒温箱中平皿倒置培养16～20h过夜。然后在平皿挑选氨苄抗性克隆，分别接种于3ml LB(含 Amp100μg/ml)液体培养基中，37℃振荡培养过夜。采用Plasmid Mini Kit高纯质粒提取试剂盒小量提取质粒。将重组质粒送上海生物公司测序。

1.2.7 数据处理 应用SPSS13.0统计学软件进行数据分析。数据用表示，组间比较用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各卵巢癌细胞系中TIZ基因mRNA表达情况

RT-PCR检测结果显示，卵巢癌细胞HO8910细胞无TIZ基因mRNA表达，SKOV3、SKOV3顺铂耐药、SKOV3卡铂耐药、A2780、A2780卡铂耐药细胞株等均有TIZ基因mRNA表达。结果见图1。

图1 TIZ基因在不同卵巢癌细胞株中的表达

2.2 实时荧光定量PCR检测TIZ和β-actin mRNA的标准曲线与融解曲线的建立

由图2、图3可见，TIZ和β-actin基因标准曲线相关系数分别为0.998和0.991，表明曲线线性关系良好，用于分析样品表达量的结果可信。融解曲线图显示基因扩增成单峰，无杂峰，TIZ峰值位于84.5℃，βactin H峰值位于84.8℃(图4、5)。

图3 TIZ/pTG19-T质粒标准扩增曲线

2.3 TIZ-siRNA干扰片段细胞内介导前后细胞系TIZ mRNA表达的测定

由表1可见，TIZ-siRNA 554、652和573干扰片段细胞内介导后均可下调细胞TIZ mRNA表达，其中652和573干扰片段细胞内介导后下调细胞TIZ mRNA表达相对拷贝数，与阳性对照组和阴性对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)，其中又以TIZ-573下调TIZ扩增拷贝数最明显。对TIZ-基因沉默率达60%。见图8。

表1 转染不同siRNA后QRT-PCR检测TIZ基因拷贝数

图6 不同siRNA对TIZ基因的抑制率

2.4 TIZsiRNA重组表达载体测序结果

将构建好的TIZ-573siRNA、阳性对照siRNA、阴性对照siRNA分别送北京诺赛生物公司测序，测序结果在NCBI上进行BLAST比对，将结果同源性达到97%以上送测序。TIZ基因干扰载体pGPU6/GFP/Neo-TIZ-573测序结果见图7。

图7 pGPU6/GFP/Neo-TIZ-573测序图

3 讨论

TIZ基因位于19q13上，C端有14个重复的锌指蛋白结构域，因此也将此蛋白命名为锌指蛋白675(ZNF675)。TIZN端(95aa～213aa)的锌指结构与TRAF-6 N端的环指结构结合造成TRAF-6构型的改变，抑制了TRAF-6对下游信号分子的转导作用［3］。已有研究证实TRAF-6参与了多种信号转导因子如NF-κB、JNK、C-FOS 等的活化［4～8］，进而激活了如细胞间黏附分子1(ICAM-1)、血管内皮生长因子(VEGF)、尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)等，这些细胞信号转导因子参与肿瘤的发生和发展过程［8，9］。

至于TIZ基因在卵巢恶性肿瘤中发挥何种作用，目前尚无文献报道。本课题前期通过构建卵巢癌患者腹水肿瘤细胞cDNA文库，采用改良的重组克隆表达抗原的血清学鉴定(SEREX)技术与抑制性消减杂交(SSH)方法相结合的策略，从文库中筛选相关抗原基因 TIZ，采用重组肿瘤抗原的微量血清学检测(SMARTA)法检测TIZ抗原与卵巢癌患者和正常妇女的血清中相应自身抗体的阳性反应情况，结果示TIZ基因的重组抗原与卵巢癌患者血清中相应IgM型自身抗体反应的阳性率高于正常妇女血清反应的阳性率，差异均有统计学意义(P＜0.05)［2］。因此，极有必要进一步探讨TIZ基因在卵巢恶性肿瘤中的生物学作用。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指通过双链RNA(double strand RNA，dsRNA)在特定酶参与下，特异性地抑制靶基因的转录后表达的现象。它通过人为地引入与内源靶基因具有同源序列的双链RNA，诱导内源靶基因的mRNA降解，达到阻止基因表达的目的。是研究基因功能的重要技术方法［10］。siRNA介导细胞目前有瞬时转染与稳定转染二种方式。本研究采用构建稳定转染重组表达载体方式，主要是基于TIZN端(95～213aa)的锌指结构与TRAF-6 N端的环指结构结合造成TRAF-6构型的改变，从而发挥生物作用，TIZ可能是通过调节信号传导通路而发挥作用而并非直接作用［3］。而稳定介导并沉黙TIZ基因后，有助于有充分的时间空间观察TIZ基因敲除后对其所调节上下游基因的影响。

在siRNA实验中有两个关键点，一是靶细胞的选择，它必须是被敲除目的基因的表达阳性者，本实验采用RT-PCR方法检测不同卵巢癌细胞株TIZ基因的表达情况，结果显示卵巢癌细胞HO8910细胞无TIZ基因 mRNA表达，而 SKOV3、SKOV3顺铂耐药、SKOV3卡铂耐药、A2780和A2780卡铂耐药细胞等均有TIZ基因mRNA表达。因此选择SKOV3作为TIZ基因敲除的靶细胞对象。二是选择有效的siRNA片段，由于siRNA片段设计从转录本(mRNA)的AUG起始密码开始，寻找AA或者NA的二连序列，并记下其3’端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。同时于不同序列siRNA片段的结合复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA，从而影响siRNA效果［11］，因此选择有效的siRNA片段非常关键。本实验经瞬时转染筛选，结果发现573号siRNA片段可以有效抑制TIZ基因mRNA的表达，573号干扰片段细胞内介导后下调细胞TIZ mRNA表达相对拷贝数最明显，与阳性对照组和阴性对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)，对TIZ基因沉默率达60%，进而选择573号siRNA构建了pGPU6/GFP/Neo-TIZ-573干扰载体，为进一步研究TIZ基因的功能及探讨以TIZ基因为靶点的基因治疗奠定了基础。

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