CO2对宫颈癌Hela细胞CDK9基因表达的影响

潘灵辉 林 飞 李 力 黄 冰

目前研究发现细胞周期依赖性激酶(cyclindependent kinases，CDKs)家族有 9个成员(CDK1～CDK9)，根据其功能分为两大类:控制细胞周期的CDKs和控制细胞转录的CDKs。CDK9属于控制细胞转录的细胞周期依赖性激酶。CDK9是正性转录延长因子b(positive transcription elongation factorb，P-TEFb)中的催化亚基成分，通过磷酸化RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymeraseⅡ)和一些负性转录延长因子，从而使转录从起始部位得以延伸。CDK9/cyclin T的异常表达与很多疾病的发生有密切关系。CDK9/cyclin T将给艾滋病和肿瘤等疾病的治疗提供颇有应用前景的作用靶点。

前期我们利用基因芯片研究发现，模拟气腹CO2作用宫颈癌Hela细胞后显示其基因差异表达，其中，对周期蛋白依赖性蛋白激酶-9(cyclin dependent kinase，CDK9)基因的影响如何，其表达改变是否有促进癌细胞分化、增生、迁移和浸润的作用?因此CO2是否能够促进肿瘤生长、浸润和转移等成为研究的重点。有报道CDK9属于宫颈癌的抑癌基因［1］。因此，本研究应用实时荧光定量PCR(Real Time-PCR)技术对CDK9-mRNA进行定量检测，并分析其结果，进一步探讨宫颈癌Hela细胞经CO2作用后对细胞生长周期、增殖、浸润和转移等的影响，以探讨其临床应用价值。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

逆转录试剂盒采用英国Invitrogen公司产品，SYBE Green采用英国Qiagen公司，PTG-19T质粒购自中国上海捷瑞生物工程有限公司，质粒小提试剂盒购自中国三博远志公司，TAQ酶购自日本TaKaRa公司，荧光定量EP管购自Anxgen公司，828型pH仪购自美国ORION公司，大型多功能分光光度计购自日本岛津公司，Geldoc 2000凝胶成像分析系统购自美国Bio-Rad公司，DNA扩增仪购自美国Thermo公司，多通道PCR仪为美国MJPT-220产品，iCycler iQTM实时荧光PCR检测仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 细胞培养

宫颈癌Hela细胞株为广西医科大学附属肿瘤医院实验研究部提供。经过细胞复苏及传代后，将细胞悬液置入25ml培养瓶，37℃培养箱内培养，利用对数生长期细胞进行实验。

1.3 CO2体外气腹模型的建立

自制一有机玻璃容器，侧面设置进气孔及出气孔，进气孔控制进气流量和速度;出气孔监测和控制CO2压力。实验前玻璃容器经过消毒灭菌和真空处理后，密封并灌入CO2至实验所需的压力，并维持实验时间。

1.4 实验分组

模拟CO2气腹环境，将接种的宫颈癌Hela细胞于37℃细胞孵箱内培养24h后，随机分为3组:A组置于CO2气腹模型内，在纯CO2压力8mmHg下通气4h，培养24h;B组置于CO2气腹模型内，在纯CO2压力8mmHg下通气4h，培养120h;C组为对照组的细胞始终置于常规细胞培养箱中培养。

1.5 细胞总RNA提取

按照试剂盒说明书采用Trizol法提取总RNA，以吸光度A260/A280比值为1.8～2.0判定提取质量和吸光度计算总RNA浓度。

1.6 mRNA逆转录cDNA合成

按试剂盒说明书操作，反应体系12μl。取5×AMV缓冲液，dNTP终浓度1mmol/L，MgC12终浓度5mmol/L，RNase inhibitor 1μl，Oligo(dt)18primer 1μmol/L，Amvrtase1U，标本总 RNA 2μg，加 DEPC 水至12μl，70℃ 5min，42℃ 60min，72℃ 10min 灭活逆转录酶，5℃ 5min进行逆转录。合成好的 cDNA置-20℃保存备用。

1.7 定量模板的克隆和制备

CDK9基因和内参照基因GAPDH的PCR产物纯化后，采用PTG-19T Vector进行高效克隆，所得质粒用PCR方法进行验证。将微量质粒转入EcoliDH5α感受态细胞，氨苄青霉素筛选后抽提质粒，测序后证实内参照GAPDH和CDK9序列cDNA完全正确。抽提的质粒PTG-19T Easy-GAPDH和PTG-19T Easy-CDK9分别在260nm下测A260值，计算拷贝数后，用TE稀释至109拷贝/μl于-20℃保存备用。

1.8 实时荧光定量PCR检测

根据Genebank人类的CDK9基因的cDNA序列，应用引物设计软件Primer5设计引物CDK9引物序列为:上游引物5'GGTCAAGTTC-ACGCTGTCTG 3'(452～471)，下游引物 5'GCCTTCATG-TCCCTATGC 3'(553～570)。看家基因GAPDH作为同源对照，核酸序列库号为BT006893，核酸序列如下:上游引物5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3'(6～23)，下游引物5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'(212～231)，扩增片断为225bp。在SYBR荧光实时定量PCR程序最后一步加入熔解曲线分析。从55℃到99℃，温度每升高0.4℃进行1次读板，反应结束后，由电脑自动分析并计算结果。荧光定量PCR的检测采用相对定量法检验基因的表达变化，GAPDH作为内参基因与对照组、A实验组、B实验组的CDK9同时行PCR反应，并分析结果。用light Cycler荧光定量PCR扩增仪进行PCR反应，在PCR反应的同时，每扩增1次循环，检测1次PCR产物量。按照下列公式计算样本中CDK9 mRNA的相对表达量［2］:目的基因相对量=目的基因拷贝数/内参基因拷贝数，即算出对照组、A、B实验组的CDK9 mRNA的相对量，并与对照组进行对比。

1.9 统计学分析

采用SPSS13.0统计软件包对 A、B、C组 CDK9 mRNA表达进行比较，采用独立样本t检验和单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞总RNA

结果见图1。紫外灯下可见28s、18s、5s等3条rRNA的清晰带，为细胞总RNA经1%琼脂糖凝胶电泳图，可见28s/18s＞1.80，证明各mRNA完好，可以作为逆转录模板进行下一步实验。

图1 细胞总RNA电泳图

2.2 目的基因(CDK9)RT-PCR检测

CO2通气处理后A、B组细胞株，抽提组织总RNA，使用逆转录试剂盒制备cDNA第一链，以总cDNA为模板扩增CDK9基因，产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果目的基因CDK9扩增长度为102bp(图2)，符合扩增片段大小，切取目标条带，进行纯化、回收。

图2 CDK9基因扩增结果

2.3 内参基因GAPDH的实时荧光定量PCR检测

Hela细胞经CO2通气处理后，进行实时荧光定量PCR，检测A、B、C组细胞株看家基因GAPDH的稳定表达，结果荧光量的增长曲线符合标准的“s”形荧光扩增曲线(图3、图4)，出现单一的熔解峰(图5)，证实逆转录所得产物cDNA的完整性和PCR反应是成功的。

2.4 目的基因CDK9实时荧光定量PCR检测

细胞株经CO2通气处理后，目的基因CDK9 cDNA片断，荧光量的增长曲线符合标准的“s”形荧光扩增曲线(图6)，软件自动算出CDK9基因初始cDNA(相当于mRNA)的拷贝数。根据目的基因与内参基因的比值，计算CO2处理前后细胞中的CDK9基因相对表达量(表1)。A、B组与C组的CDK9基因相对表达量比较，其基因相对表达量明显下调，差异有统计学意义(P＜0.05);A、B两组比较，B组CDK9基因相对表达量下调明显低于A组，差异有统计学意义(P＜0.01)，由此可见，宫颈癌Hela细胞株经CO2作用后，CDK9基因的表达明显降低，且作用时间越长，CDK9基因相对表达量降低越明显。

图6 CDK9实时定量PCR扩增曲线

表1 CDK9质粒实时定量RT-PCR检测结果(CDK9质粒相对量)

3 讨论

细胞的增殖、分裂是肿瘤发生的基础，细胞周期的调控因子主要有细胞周期蛋白(cyclin)和周期蛋白依赖性蛋白激酶(cyclin dependent kinase，CDK)。CDK的催化亚单位与cyclin形成复合物参与发挥作用。在细胞周期的不同时相中都有特定的CDK复合物参与。目前已发现至少有9种CDK，其中参与细胞周期调控的有CDK1～CDK7，CDK8和CDK9是转录的调控因子［1］。cyclins至少有15种，CDK与各自相关的cyclin形成复合物，分别对细胞周期的各个周期进行调节，如CDK4和CDK6形成复合物对G1期的调节，CDK2和cyclin E的复合物参与G1向S期的转变，CDK2和cyclin A形成复合物调节S期的进行，CDK1复合物(又称为cdc2)与cyclin B的复合物是有丝分裂所必需，这些复合物由内源性CDK抑制剂CDK1(cyclin dependent kinase inhibitor)调节，包括p15、p16、p18、p21、p27、p53 及 RBgene 等，它们通过多种途径共同调控着细胞周期的进行。

CDK9是细胞周期依赖性激酶(cyclin-dependent kinases，CDKs)家族9个成员(CDK1～CDK9)其中之一［2］，根据其功能分为两大类:控制细胞周期的CDKs和控制细胞转录的CDKs，CDK9属于后者，CDK9是正性转录延长因子b(positive transcription elongation factor-b，P-TEFb)中的催化亚基成分，通过磷酸化RNA聚合酶Ⅱ(RNA poly meraseⅡ)和一些负性转录延长因子，从而使转录从起始部位得以延伸，CDK9/cyclin T的异常表达与很多疾病的发生有密切关系，CDK9/cyclin T将给艾滋病和肿瘤等疾病的治疗提供颇有应用前景的作用靶点［3］。CDK9表现为抑制EB病毒的生长［4］。有研究表明CDK9属于宫颈癌抑癌基因［5］。

大量的实验与临床研究证实，细胞的增殖、分化、衰老和凋亡均是细胞周期依赖性的，抑制肿瘤细胞cyclins的表达，上调CKIs表达，均可选择性地抑制肿瘤组织CDKs的活性，阻止肿瘤细胞的异常增殖［6］。肿瘤的发生可能是细胞周期调控异常的结果，细胞周期的内源性调控主要是通过磷酸化和去磷酸化为基础的周期素CDK-CDK抑制途径实现的，其核心机制是CDK活性的表达和调控，CDK基因及其表达产物的异常改变可使细胞失控性生长，从而导致肿瘤产生［7，8］。

鉴于上述原因，本实验选择CDK9基因作为研究对象，进一步探讨经CO2作用后导致Hela细胞增殖、生长的基本机制。从基因芯片分析中，我们发现CDK9基因在A、B两组中基因表达均下调。利用荧光实时RT-PCR相对定量方法，检测两实验组CDK9 mRNA的表达相对量，结果显示:与对照组比较，A、B实验组的CDK9 mRNA表达相对量比对照组明显较少;同时，B组与A组比较，B组CDK9的表达相对量比A组减少更为明显。说明两组细胞株在CO2作用下CDK9 mRNA受到抑制并出现基因表达下调，甚至于达到基因缺损的现象，且作用时间越长基因表达量越下降。肿瘤的发生大多是肿瘤相关基因表达失控或肿瘤抑制基因失活所致。原癌基因是生长因子信号系统的组成成分，在恶性肿瘤中其改变常为点突变、扩增、染色体转位和基因剪切等。许多原癌基因的表达产物对细胞膜的稳定、受体的活性、信号传递、酶的活性和基因的表达具有显著的调节作用。抑癌基因是正常的细胞基因，有诱导组织分化、细胞凋亡和调节细胞生长等功能，一旦突变和缺失，可导致癌的发生。

综上，本实验 Hela细胞经 CO2作用后，导致CDK9 mRNA表达下调，但是否能够影响宫颈癌Hela细胞的生长周期，促使Hela细胞生长，导致癌细胞增殖、种植等，有关方面有待进一步研究和验证。

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［2］ Bark-Jomes ST，Webb HM，West MJ，et al.EBV EBNA2 stimulates CDK9-dependent transcription and RNA polymerase II phosphorylation on serine 5［J］.Oncogene，2006，25(12)∶1775-1785.

［3］ Wei P，Garber ME，Fang SM，et al.A novel CDK9-associated C-type cyclin interacts directly with HIV-1 Tat and mediates its high-affinity，loop-specific binding to TAR RNA［J］.Cell，1998，92(4)∶451-462.

［4］ Ramdass B，Maliekal TT，Lakshmi S，et al.Coexpression of Notch1 and NF-kappaB signaling pathway components in human cervical cancer progression［J］.Gynecologic Oncology，2007，104(2)∶352-361.

［5］ Ravid D，Maor S，Werner H，et al.Caveolin-1 inhibits anoikis and promotes survival signaling in cancer cells［J］.Enzyme Regul，2006，7∶1-13.

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［7］ Murray AW，Marks D.Can sequencing shed light on cell cycling?［J］.Nature，2001，409(6822)∶844-846.

［8］ 田翠孟，魏素菊.细胞周期蛋白依赖性激酶与肿瘤关系的研究进展［J］.实用肿瘤杂志，2010，25(4)∶499-502.