广西壮族非小细胞肺癌患者EGFR基因突变的研究

利基林 林书瀚 唐艳萍 谭晓玉 黎远冬 邓 伟 欧 超 容敏华 沈筱芸 张力图

肺癌是威胁人类健康最主要的恶性肿瘤之一，其生存率低。近年来，以表皮生长因子受体(EGFR)为靶标的肺癌分子靶向治疗已引起普遍关注。EGFR是一种受体型酪氨酸激酶，在许多肿瘤中过表达和(或)发生突变，通过信号转导控制肿瘤生长，并与新生血管生成、肿瘤侵袭和转移等有密切的关系。EGFR酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors，TKI)的药物，以吉非替尼(gefitinib)为代表，在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)特别是在肺腺癌的治疗中显示出很好的抗肿瘤疗效。有研究［1］表明:ECFR基因外显子19～21突变与肺癌患者对吉非替尼的敏感性有关。因此，依据EGFR基因检测结果选择治疗对象，通过筛选最适合的患者，进行有针对性地靶向治疗，从而可显著提高药物疗效。目前已有肺癌EGFR基因突变的研究，但尚未有广西壮族人群的相关报道。本研究检测163例广西壮族NSCLC患者的EGFR突变情况，并与国内8个省市地区进行比较，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取广西医科大学附属肿瘤医院收治的广西籍壮族NSCLC患者163例，其中男性111例，女性52例;年龄27～83岁，中位56.5岁。病理组织学分型:腺癌95例，鳞癌26例，腺鳞癌14例，其他28例。

1.2 标本采集

1.2.1 收集新鲜肿瘤组织:肺癌组织手术切除后快速放入液氮中冻存，然后置于-80℃低温冰箱保存。

1.2.2 肿瘤组织病理石蜡切片:厚度为6μm，切片不少于10片，直接用干净的镊子将组织切片转移至干净的1.5ml离心管。

1.3 DNA提取

1.3.1 取新鲜肿瘤组织约50mg，用QIAGEN公司的DNeasy Blood＆Tissue Kit(商品序列号:69504)提取DNA，紫外分光光度计测定DNA纯度及浓度。

1.3.2 肿瘤组织行病理切片10片，用QIAGEN公司的 QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(商品序列号:56404)提取DNA，以紫外分光光度计测定DNA纯度及浓度。

1.4 实时荧光定量PCR扩增

采用扩增耐突变系统 (amplification refractory mutation system，ARMS-PCR)法扩增 EGFR基因18、19、20及21外显子。具体操作方法参照人类EGFR基因29种突变检测试剂盒(荧光PCR法)(厦门艾德生物医药科技有限公司)说明书进行，反应循环参数:95℃ 5min;95℃ 25s，64℃ 20s，72℃ 20s，循环 15 次;93℃ 25s，60℃ 35s，72℃ 20s，循环 31 次。

1.5 统计学分析

采用SPSS 13.0软件进行χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EGFR基因突变的检出率

163例NSCLC标本中共检出EGFR基因突变73例，总检出率为44.8%。其中外显子18突变7例，占9.6%;外显子19突变28例，占38.4%;外显子20突变10例，占13.7%;外显子21突变28例，占38.4%。以外显子19及21突变较为多见。

2.2 EGFR基因突变与患者性别及组织类型的关系

本组男性患者(n=111)和女性患者(n=52)的EGFR基因突变率分别为38.7%(43/111)、57.7%(30/52)，女性患者的突变率明显高于男性(P＜0.05)。95例腺癌中48例(50.5%)发生突变，26例鳞癌中8例(30.8%)突变;14例腺鳞癌中11例(78.6%)突变，其他组织类型的28例标本中发生EGFR突变6例(21.4%)。

2.3 我国肺癌EGFR基因突变发生率的情况

本研究收集、整理近几年我国台湾和广东、云南、湖南、上海、天津、北京、吉林等8个省市关于EGFR基因突变的报道资料，并与广西壮族NSCLC患者EGFR基因突变进行统计分析和比较。检测全国8个省市总计737例肺癌病例，结果有221例NSCLC EGFR 基因发生突变，突变率为 30.0%［2～8］。见表 1。本研究EGFR基因突变检出率为44.8%，显著高于文献报道国内8个省市的总体水平(30.0%)(χ2=13.29，P ＜0.05)。

表1 我国8个省、市肺癌EGFR基因突变情况

3 讨论

临床上使用较多的吉非替尼是一种新型的EGFR受体酪氨酸激酶口服抑制剂，作为分子靶向药物，目前已成为治疗非小细胞肺癌患者的一种有效措施，在NSCLC治疗中有显著的抗肿瘤作用。然而，国际多中心、随机化临床试验的结果显示，吉非替尼的总体有效率仅为10% ～30%［9］，提示此类药并非对所有肺癌患者都具有疗效。有研究表明吉非替尼的疗效与EGFR基因外显子18、19、20和21(编码胞内酪氨酸激酶活性区域)的突变有关。基因突变位于EGFR酪氨酸激酶活性区域的ATP结合位点，这些位点的突变可以使活化信号更加强烈和持久，这也是EGFR受体酪氨酸激酶抑制剂对EGFR基因突变的肺癌有效的原因［10］，并且还证明了EGFR突变与肿瘤的组织学类型、人种、性别等临床特征有关。由此提示EGFR突变可作为预测对酪氨酸激酶抑制剂疗效敏感的指标，EGFR基因突变检测对于临床肺癌患者的个体化治疗具有重要的参考价值。

本研究163例NSCLC中共检测到EGFR基因突变73例，总突变率为44.8%。其中男性患者EGFR基因突变率为38.7%(43/111)，女性患者EGFR基因突变率为57.7%(30/52)。女性患者EGFR基因突变率显著高于男性患者EGFR基因突变率(P＜0.05)。这与文献报道的结果相同。EGFR突变具有性别差异，目前还没有明确的解释，其确切机制还需进一步阐明，推测与雌激素有关。在NSCLC细胞株和小鼠移植模型的实验中，发现雌激素受体拮抗剂和吉非替尼间具有协同效应，从而推测EGFR通路和雌激素受体间存在相互作用。本研究的突变主要发生在外显子19和21，两者均为28例突变，各占突变总数38.4%，这与我国EGFR基因突变的主要形式一致［9］。本研究还发现广西壮族NSCLC患者EGFR基因突变主要以腺型(包括腺癌和腺鳞癌)为主，其突变发生率占该组织类型病例数的54.1%及突变总数的80.8%(59/73)，这与国内外的相关报道相似。

本研究受试对象均为广西壮族NSCLC患者，为了进一步探讨EGFR基因突变与民族的差异性，我们将本实验结果与国内部分的相关报道(包括台湾、广东、云南、湖南、上海、天津、北京、吉林等)进行了比较，并对这些省市共737例肺癌EGFR突变进行综合分析，结果该8个省、市肺癌 EGFR基因突变率为30.0%，与之前有学者［9］于2005年对北京、上海、云南、广东及台湾等5个省、市地区统计的突变率(34.0%)相近。本实验显示，广西壮族肺癌患者EGFR基因突变率(44.8%)，显著高于我国8个省市地区肺癌EGFR基因突变的水平(P＜0.05)。我国民族众多，各地肺癌EGFR基因突变存在差异，广西壮族NSCLC患者EGFR基因突变率比我国部份地区EGFR基因突变水平相对较高，这可能与民族种类、遗传背景、地域差异等因素相关，有关方面仍需深入探讨和研究。

综上，广西壮族NSCLC患者的EGFR基因突变率显著高于中国部份地区总体水平，且与患者性别、病理类型有关，主要见于女性、腺癌和腺鳞癌，这些是选用EGFR酪氨酸激酶抑制剂的优势人群。由于NSCLC中EGFR基因突变与EGFR酪氨酸激酶抑制剂的药物治疗敏感性显著相关，临床上应根据EGFR突变情况来选择用药，发挥分子靶向药物的疗效，使广大肺癌患者受益。

［1］ Gazdar AF，Minna JD.Inhibition of EGFR signaling:all mtations are not created equal［J］.PLoS Med，2005，2(11)∶1085-1087.

［2］ Huang SF，Liu HP，Li LH，et al.High frequency of epidermal growth factor receptor mutations with complex patterns in non-small cell lung cancers related to gefitinib responsiveness in Taiwan ［J］.Clin Cancer Res，2004，10(24)∶8195-8203.

［3］ Qin BM，Chen X，Zhu JD，et al.Identification of EGFR kinase domain mutations among lung cancer patients in China:implication for targeted cancer therapy［J］.Cell Research，2005，15(3)∶212-217.

［4］ 奉水东，谭红专，胡国斌，等.PCR-SSCP检测非小细胞肺癌EGFR基因突变的敏感性分析［J］.实用肿瘤杂志，2008，23(4)∶307-310.

［5］ 姜 斌，朱冠山，刘 峰，等.中国人非小细胞肺癌EGFR基因突变的研究［J］.上海第二医科大学学报，2005，25(11)∶1148-1150.

［6］ 刘红雨，李 颖，陈 钢，等.187例非小细胞肺癌中EGFR基因突变和扩增的检测及其临床意义［J］.中国肺癌杂志，2009，12(12)∶1219-1228.

［7］ Mu XL，Li LY，Zhang XT，et al.Gefitinib-sensitive mutations of the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase domain in chinese patients with non-small cell lung cancer［J］.Clin Cancer Res，2005，11(12)∶4289-4294.

［8］ 尹光浩，刘 伟，刘国津，等.非小细胞肺癌的EGFR表达与EGFR基因突变的比较［J］.中国实验诊断学，2009，13(2)∶200-202.

［9］ 董强刚.肺癌靶向治疗研究进展与我国肺癌的EGFR基因突变概况［J］.肿瘤，2005，25(6)∶625-628.

［10］ Shigematsu H，Lin L，Takahashi T，et al.Clinical and biological features associated with epidermal growth factor receptor gene mutations in lung cancers［J］.J Natl Cancer Inst，2005，97(5)∶339-346.