弥漫大B细胞淋巴瘤患者血浆MGMT基因甲基化与化疗疗效关系

康马飞 骆梅青 刘 瑛 廖漓漓 陈 莹

一部分弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)对标准化疗方案(CHOP)抗拒或继发性耐药，其原因不明。O6甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT)是一种非常重要的DNA修复酶。烷化剂的细胞毒作用主要是由于DNA内O6位鸟嘌呤烷基化所引起，MGMT将烷基从O6鸟嘌呤转移到半胱氨酸残基内，修补DNA的完整性。肿瘤细胞对烷化剂耐药常与高水平的DNA修复蛋白MG-MT有关。研究表明，甲基化是MGMT基因失活的主要机制之一，MGMT基因甲基化可使MGMT表达和活性明显下降，因此，MGMT甲基化从另一方面反映了MGMT的表达和活性。本研究通过观察30例弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者血浆甲基化MGMT基因在化疗前后的表达情况，了解血浆甲基化MGMT基因表达与化疗疗效之间的关系，为血浆甲基化MGMT基因表达能否作为DLBCL化疗疗效预测指标提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 一般资料

收集2008年10月至2010年4月期间桂林医学院附属医院肿瘤内科收治且经病理确诊的30例DLBCL患者，男性18例，女性12例，年龄34～76岁，中位年龄为54岁。测定所有患者化疗前的血浆甲基化MGMT基因表达情况。所有患者均给予CHOP方案(环磷酰胺750mg/m2，第1天;阿霉素50 mg/m2，第1天;长春新碱1.4 mg/m2，第1天;强的松60 mg/m2，第1～5天;每21d重复)治疗，每2个周期评价疗效1次，并测定所有患者的血浆甲基化MGMT基因表达，共6个周期。

1.2 疗效判断标准

按“Cheson淋巴瘤疗效标准”进行疗效评价，分为 CR、CRu、PR、SD 和复发/PD，总有效率(ORR)=CR+CRu+PR。

1.3 实验方法

1.3.1 标本采集

分别于患者化疗前、第3个化疗周期前、第5个化疗周期前收集其周围静脉血液标本2ml于EDTA抗凝管中，以3 000r/min离心15min分离获得血浆，将血浆置于-20℃保存备用，用于测定甲基化MGMT基因检测。

1.3.2 DNA的提取

血浆DNA的提取采用CWBIO康为世纪公司的TissueGen DNA Kit(ca.t no.CW0546)试剂盒，操作步骤如下:①取 100μl样品加入 Buffer GTL补足至200μl;②加入200μl proteinase K，涡旋震荡使样品彻底混匀;③加200μl Buffer GL，涡旋震荡充分混匀，加入200μl无水乙醇，涡旋震荡充分混匀;④将步骤3所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中，10 000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中;⑤向吸附柱中加入500μl Buffer GW1，10 000 r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中;⑥向吸附柱中加入500μl Buffer GW2，10 000r/min 离心 1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。重复该步骤一次;⑦12 000r/min离心2min，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干;⑧将吸附柱置于一个新的离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入50～200μl Buffer GE，室温放置5min，10 000r/min离心1min，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。

1.3.3 DNA的修饰

血浆中肿瘤细胞释放的DNA经过亚硫酸氢钠修饰，CpG中未甲基化的胞嘧啶被转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则不发生变化。修饰过程:①取20μl DNA，加入装有 130μl CT Conversion Reagent solution的PCR 管中，98℃水浴8min，64℃金属浴3.5h，4℃冰箱保存20h。②往已装入收集管的吸附柱中加入600μl M-Binding Buffer。③把步骤①所得的150μl液体全部加入到收集管中，10 000r/min离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。④向吸附柱中加入100μl M-wash Buffer，10 000r/min离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。⑤向吸附柱中加入200μl M-Desulphonation Buffer，置室温(20 ～30℃)20min，10 000r/min 离心 30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。⑥向吸附柱中加入200μl M-wash Buffer，10 000r/min离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。再重复实验步骤1次。⑦把吸附柱放入1.5ml的EP管中，向吸附柱中加入10μl M-Elution Buffer，10 000r/min离心 30s，收集 DNA 溶液，-20℃保存DNA。

1.3.4 引物序列及巢式PCR检测

巢式PCR按照文献报道的方法进行［1］，所用的引物序列及产物片断大小为MGMT-F(160bp)上游引物:5'-GYGTTTYGGATATGTTGGGATAGTT-3'，下游引物:5'-AAACTCCRCACTCTTCCRAAAAC-3';MGMT-M(81bp)上游引物:5'-TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC-3'，下游引物:5'-GCACTCTTCCGAAAACGAAACG-3';MGMT-U(93bp)上游引物:5'-TTTGTGTTTTGATGTTTGTAGGTTTTTGT-3'，下游引物:5'-AACTCCACACTCTTCCAAAAACAAAACA-3'。MGMT-M用于扩增MGMT基因5'CpG岛甲基化等位基因，MGMT-U用于扩增MGMT基因5'CpG岛非甲基化等位基因。PCR分两步进行:首先用MGMT-F扩增富含CpG的启动子区片段，反应条件为:5×GoldStar Taq MasterMix 12.5μl，上下游 Primer各1μl，DNA 10μl，加 RNase Free dH2O至 25μl。95℃ 预变性 10min，进入循环:95℃ 变性30s，56℃退火 30s，72℃延伸 30s，35 个循环后 72℃ 延伸5min。反应产物稀释30倍，取2μl进行第2轮PCR反应，反应条件为:5×GoldStar Taq MasterMix 12.5μl，上下游 Primer各 1μl，DNA 2μl，加 RNase Free dH2O至25μl。95℃预变性10min，进入循环:95℃变性30s，56℃ 退火 30s ，72℃ 延伸 30s，35 个循环后72℃延伸5min。PCR反应试剂盒25μl(CWBIO康为世纪公司，2×GoldStar Taq MasterMix(Ca.t no.CW0939)。对全部亚硫酸氢钠处理后的DNA样品同时进行了MGMT基因的非甲基化分析，均可以观察到非甲基化产物，验证了DNA的修饰反应是成功的。

1.3.5 SssI酶处理

为保证检测的可靠性，以经SssI酶处理和未经SssI酶处理的正常人外周血淋巴细胞DNA分别作为MGMT基因启动子甲基化的阴性和阳性对照。SssI酶处理步骤:10 × NE Buffer2 4μl，200 × SAM 0.5μl，DNA 5μl，SssI酶(4U/μl)1.5μl，加 RNase Free dH2O至40μl。37℃水浴 4h，65℃金属浴 15min灭活 SssI酶，按照1.3.3步骤甲基化修饰及1.3.4的步骤进行巢氏PCR。

1.3.6 凝胶电泳分析

取5μl扩增产物，用2.0%的琼脂糖凝胶进行电泳鉴定，溴化乙啶染色，用凝胶电泳成像仪进行拍照分析。

1.4 统计学处理

用SPSS 17.0软件进行统计分析，计数资料的差别比较用χ2检验。P＜0.05为差别有统计学意义。

2 结果

2.1 化疗前血浆甲基化MGMT基因表达与化疗疗效的关系

30例DLBCL患者血浆MGMT基因甲基化率为63.3%(19/30)，血浆MGMT基因甲基化者化疗有效率为100.0%(19/19)，血浆MGMT基因非甲基化者化疗有效率为72.7%(8/11)，甲基化与非甲基化患者比较，化疗有效率差异有统计学意义(Fisher精确概率法，P=0.041。)其电泳图见图1。

图1 血浆MGMT基因甲基化和非甲基化的电泳图

2.2 化疗后血浆甲基化MGMT基因表达与化疗耐药的关系

血浆MGMT基因甲基化者化疗后4个周期无效者1例，化疗6个周期后有1例出现耐药，耐药发生率为10.5%(2/19)。血浆MGMT基因非甲基化者化疗后2个周期无效者3例，化疗后4个周期无效者1例，化疗后6个周期无效者2例，化疗后耐药发生率为54.5%(6/11)。两组耐药发生率比较，差异有统计学意义(χ2=4.836，P=0.028)。

3 讨论

MGMT基因定位于10q26，编码产物MGMT是一种非常重要的修复蛋白。在烷化剂治疗过程中，肿瘤O6烷基鸟嘌呤修复程度依赖于细胞内MGMT的原始水平和新MGMT蛋白合成的程度。未能修复的O6甲基(或氯乙基)鸟嘌呤损害导致致命的DNA链内交联，导致肿瘤细胞死亡。提高烷化剂抗癌药临床疗效的一条途径是降低肿瘤细胞内MGMT的活性。大量研究表明，MGMT mRNA的表达水平决定MGMT蛋白水平，而MGMT蛋白水平直接反映MGMT酶活性［2］。

研究表明，MGMT基因甲基化可使MGMT表达和活性明显下降。因此，MGMT甲基化基因表达情况从另一方面反映了MGMT的表达和活性。Blough等［3］的研究结果表明，肿瘤组织中MGMT启动子甲基化预示将获益于烷化剂替莫唑胺(TMZ)化疗。此外，MGMT启动子甲基化还是一个良好的无进展生存预后指标［4，5］。

临床上因有的肿瘤不易取到组织，或不易在肿瘤治疗过程中反复获取组织，所以有学者开始寻找更方便获得标本的方法(如血液)评价肿瘤细胞MGMT基因甲基化情况。研究发现肿瘤患者血浆DNA与肿瘤组织存在一致的基因改变。Balana等［6］比较了多形性恶性胶质瘤肿瘤组织的甲基化MGMT DNA与血浆甲基化MGMT DNA的关系，结果显示，MGMT DNA甲基化情况在肿瘤和血浆中是一致的。

在DLBCL与MGMT甲基化关系的研究中，有研究者发现，DLBCL患者 MGMT蛋白表达阴性率为30.2%，MGMT蛋白表达阴性者，MGMT启动子甲基化达88.2%，而MGMT蛋白表达阳性者，MGMT启动子甲基化仅19.0%，提示MGMT蛋白表达缺乏与启动子甲基化相关［7］，说明启动子甲基化与MGMT蛋白表达呈负相关。但有研究却发现，DNA甲基化测定不一定能准确预告基因静默状态［8］，MGMT表达与非甲基化状态，MGMT不表达与甲基化状态关系不大［9］。有研究显示，MGMT基因表达与肿瘤细胞对烷化剂的敏感性密切相关，其启动子甲基化使MGMT失活，38.8%DLBCL患者的MGMT启动子甲基化，甲基化状态与OS正相关［10］。MGMT启动子甲基化在DLBCL患者中达52.3%，启动子甲基化与化疗疗效和DFS无关，但MGMT甲基化是DLBCL的有意义的预后因素［11］。本研究中30例DLBCL患者化疗前血浆甲基化 MGMT基因的表达率为63.3%，MGMT DNA甲基化者化疗有效率为100.0%，而MGMT DNA非甲基化者有效率为72.7%，两组差异有统计学意义(P ＜0.05)。

本研究结果显示，检测血浆甲基化MGMT基因表达与DLBCL患者使用CHOP方案治疗的疗效相关，血浆甲基化MGMT基因表达可能成为DLBCL患者个体化化疗的有用指标，检测血浆甲基化MGMT基因更便于动态观察，更方便在肿瘤治疗过程中根据其表达的变化选择个体化化疗方案，提高化疗效果。

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