香丹注射液体外诱导大鼠MSCs分化为多巴胺能神经元效果观察

王福兰，李福玲，王桂荣，刘素娟

(1潍坊医学院附属医院，山东潍坊 261031;2潍坊眼科医院)

骨髓间充质干细胞(MSCs)具有多向分化潜能，来源丰富、取材简便，可进行自体移植，被认为是帕金森病(PD)等神经退行性疾病细胞替代疗法的理想来源。2009年12月～2010年12月，我们采用香丹注射液诱导大鼠MSCs向多巴胺(DA)能神经元分化，现分析结果。

1 材料与方法

1.1 材料 6周龄SD(Sprague-Dawley)大鼠，雌雄不拘，体质量150～180 g，由潍坊医学院实验动物中心提供。Heraeus HERA Cell 150型CO2培养箱(德国)，倒置相差显微镜(日本Olympus)，荧光显微镜(德国Leica公司)，重组大鼠碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、小鼠抗大鼠酪氨酸羟化酶(TH)均购自美国Sigma公司，香丹注射液购自河北天成药业有限公司，小鼠抗大鼠微管相关蛋白2(MAP2)、小鼠抗大鼠增殖细胞核抗原(PCNA)、兔抗大鼠Bcl-2均购自武汉博士德生物公司，兔抗人神经元特异性烯醇化酶(NSE)、兔抗人胶质纤维酸性蛋白(GFAP)均购自北京中杉生物技术公司。

1.2 MSCs诱导分化 参照文献［1］，分离、纯化和鉴定大鼠骨髓MSCs。取生长良好的第3代MSCs按1×105/ml密度接种于预先置有多聚赖氨酸处理过的盖玻片的24孔培养板内。待细胞生长达80%融合时分为诱导组及对照组。两组均采用高糖培养基(L-DMEM)、10%FBS和25 ng/ml bFGF预诱导24 h，诱导组再予20%香丹注射液诱导3 h。

1.3 相关指标检测 诱导后细胞爬片冷丙酮固定10 min，3%H2O2-甲醇溶液孵育30 min，消除内源性过氧化物酶的活性，正常羊血清封闭，室温，30 min，倾去多余血清，分别滴加 NSE(1∶100)、MAP2(1∶100)、GFAP(1∶100)、TH(1∶100)、PCNA(1∶100)、Bcl-2(1∶100)，4 ℃，过夜，滴加生物素化二抗，37℃，30 min，滴加辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素，37 ℃，30 min，DAB 避光显色，5 ～10 min，苏木素复染，盐酸乙醇分色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。各步骤间以0.01 mol/L PBS冲洗。PBS替代一抗作为阴性对照。光镜下观察诱导后MSCs的细胞形态。随机选择10个非重复视野(×100)，应用免疫细胞化学方法分别计数NSE、MAP2、GFAP、TH、PCNA 和 Bcl-2阳性细胞数，阳性细胞率(%)=阳性细胞数/(阳性细胞数+阴性细胞数)×100%。

1.5 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件，计量数据以±s表示，采用χ2检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

诱导组30 min后光镜下少数MSCs发生形态变化，3 h后多数MSCs胞体收缩成锥形或球形，胞体折光性变强，细胞突起变细长，可见双极细胞及多极细胞。两组诱导后NSE、MAP2、GFAP、TH及PCNA、Bcl-2表达见表1。

3 讨论

表1 两组 NSE、MAP2、GFAP、TH 及 PCNA、Bcl-2 表达(%， ±s)

表1 两组 NSE、MAP2、GFAP、TH 及 PCNA、Bcl-2 表达(%， ±s)

注:与对照组比较，*P ＜0.05

组别NSE MAP2 GFAP TH PCNA Bcl-2诱导组 70.1 ±5.7* 60.5 ±4.9* 15.4 ±3.5* 17.2 ±7.1* 4.7 ±1.4*7.9 ±1.8对照组 14.2 ±2.1 1.4 ±0.5 4.5 ±1.2 3.6 ±2.2 30.7 ±4.3 10.2 ±2.6

多种诱导因素联合应用是体外诱导MSCs定向分化为DA能神经元常用的手段之一。诱导因子bFGF不仅能提高MSCs的增殖速度和寿命，且能在增殖过程中保持其多分化潜能，并有诱导神经干细胞向神经元分化的作用［2］，还可以调节中脑DA神经元的发育和分化［3］。

复方香丹注射液由丹参和降香的水蒸气馏出液(成分为降香挥发油)组成，丹参具有活血化瘀作用，安全性好，实用价值高，是临床治疗心脑血管疾病的常用中药，其水溶性成分主要为酚性酸类化合物，包括丹参素、原儿茶醛、丹酚酸A/B等，含量最高的两个成分丹酚酸A和B活性最强，对脂质过氧化引起的细胞膜损伤有明显保护作用。降香挥发油主要作用为抗凝。本研究发现，诱导分化后的MSCs细胞NSE、MAP2、TH均呈不同程度阳性表达，提示诱导分化后的神经元样细胞已具备神经元的抗原特性。PCNA由Miyachi等于1978年在系统性红斑狼疮患者的血清中首次发现并命名，因其只存在于正常增殖细胞及肿瘤细胞内而得名，PCNA与细胞DNA合成关系密切，在细胞增殖的启动上起重要作用，是反映细胞增殖状态的良好指标。本实验结果显示，诱导后大鼠MSCs的PCNA表达明显减弱，表明细胞开始分化后其增殖力下降。为证实表达减弱是否因细胞凋亡所致，我们检测了抗凋亡因子Bcl-2的表达，结果显示诱导前后Bcl-2表达无明显差异，证实诱导后的细胞分化开始、增殖减弱。

本研究结果提示香丹注射液能诱导MSCs向神经元样细胞分化，但确切机制尚不清楚，可能与丹酚酸降低神经细胞缺氧损伤时的细胞死亡率，减少脂质过氧化物生成有关。随着研究的深入，体外神经细胞分化途径将越来越接近体内神经细胞发生，但获得大量纯化DA能神经元的更有效诱导条件还有待于进一步探索。

［1］王晓萃，吴金生，付文玉，等.诱导大鼠间充质干细胞形成的神经元样细胞的形态特征［J］.解剖学报，2007，38(1):107-110.

［2］Sun D，Bullock MR，McGinn MJ，et al.Basic fibroblast growth factor-enhanced neurogenesis contributes to cognitive recovery in rats following traumatic brain injury［J］.Exp Neurol，2009，216(1):56-65.

［3］Timmer M，Cesnulevicius K，Winkler C，et al.Fibroblast growth factor(FGF)-2 and FGF receptor 3 are required for the development of the substantia nigra，and FGF-2 plays a crucial role for the rescue of dopaminergic neurons after 6-hydroxydopamine lesion［J］.J Neurosci，2007，27(3):459-471.

［4］Dinsmore J，Ratliff J，Jacoby D，et al.Embryonic stem cells as a model for studying regulation of cellular differentiation［J］.Theriogenology，1998，49(1):145-151.