油茶皂苷通过内质网应激途径诱导人肝癌细胞HepG2凋亡的研究

马丽媛，李 林，江 玉，史丽颖，冯宝民，王永奇，唐 玲

(大连大学1.生命科学与技术学院、2.药物研究所，辽宁大连 116622;3.Kansas State University，Human Nutrition，Kansas，USA 66502)

油 茶 (Camellia oleifera Abel.)系 山 茶 科(Theaceae)山茶属油茶组植物［1］。全世界的油茶主要分布在我国的长江流域及其以南地区［2－3］。目前，我国共有油茶林资源大约5 500万亩，主要分布在我国17个省(区)。油茶树结出的果实称油茶籽或茶子心，可用来提炼茶籽油即茶油，是一种绿色、生态和高营养的保健食用油，为食用油中的珍品，堪称“东方橄榄油”［4］。茶麸系油茶果实榨除茶油的废弃残渣，茶麸药用称茶子饼，为中药大辞典和岭南草药志所收载［5］。油茶皂苷(youchasaponin)系茶麸中皂苷类成分的总称。本课题组已制备获得皂苷含量在95%以上的油茶总皂苷［6－7］，而且前期研究表明油茶皂苷体内对移植性小鼠S180肉瘤具有不同程度的抑制作用，为继续探讨油茶皂苷的抗肿瘤作用，本文拟从体外试验角度研究油茶皂苷对人肝癌细胞HepG2的作用及可能涉及到的作用机制。

1 材料

1.1 药品与试剂 油茶皂苷由大连大学生命科学与技术学院生物技术教研室制备，其总皂苷含量＞95%。细胞培养所用油茶皂苷先用无菌PBS配制后再用DMEM培养液稀释至所需浓度。

DMEM(High Glucose)培养液(Hyclone，美国);四甲基偶氮唑蓝(MTT，Sigma，美国);兔抗人Caspase-3抗体，兔抗人PARP抗体，兔抗人Bip抗体，兔抗人Perk抗体，兔抗人eIF2a抗体，小鼠抗人p-eIF2a抗体，小鼠抗人eEF2抗体，兔抗人p-eEF2抗体，小鼠抗人β-actin抗体(Cell Signaling Technology，美国);Rabbit polyclonalto IRE1和 Rabbit polyclonalto ATF6抗体(Abcam，美国)。

1.2 细胞及培养 人肺癌细胞(A549)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人肝癌细胞(HepG2)、均购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。

将A549、MCF-7和HepG2 cell分别用含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养，同时加入1×105U·L－1链霉素和 1 ×105U·L－1青霉素，于 37℃、5%CO2培养箱中全湿培养，每2～3天换液1次。

2 方法

2.1 油茶皂苷对多种肿瘤细胞增殖活性的影响采用MTT法，将处于对数生长期的A549、MCF-7和HepG2细胞制成细胞悬液，分别以细胞密度0.5×104/孔、0.6 ×104/孔和 1.0 ×104/孔，100 μl接种在96孔培养板中，贴壁24 h，吸去原有培养液，加入油茶皂苷相应浓度在含37℃、5%CO2条件下继续孵育24 h后，每孔加入MTT溶液20 μl继续培养4 h，吸弃培养液，加入100%DMSO 100 μl，经微量混合振荡器振荡10 min后，酶标仪于570 nm处测定各孔吸光度OD值。计算细胞存活率和IC50。细胞存活率/%=实验组/对照组的平均值×100%。

2.2 免疫印迹分析 选取人肝癌细胞HepG2完成免疫印迹分析。各组样品处理同前，收集细胞，4℃1 000 r·min－1离心3 min，弃培养液后用冰预冷的PBS洗2次，加入细胞裂解液(cell lysis buffer 980 μl、PI 10 μl、PPI 10 μl)，用细胞破碎仪对细胞进行破碎，3次，10s/次，30s/中间间隔，所有操作均在冰上完成。细胞破碎后放置20 min，然后4℃ 15 000 r·min－1离心30 min。吸出上清液采用BCA蛋白定量试剂盒测定各组样品蛋白浓度。变性后取40 μg总蛋白，选择10%分离胶进行SDS-PAGE电泳，90 V 2.5 h，电泳完毕后将蛋白质电转至PVDF膜。用含5%脱脂奶粉的封闭液(TDNT)封闭PVDF膜，室温下孵育1 h后，分别加1∶1 000稀释的一抗(caspase-3、PARP、Bip、ATF6、IRE1、Perk、p-eIF2a、eIF2a、p-eEF2、eEF2 和 β-actin)4℃ 孵育过夜，TDNT洗涤3次，每次5 min，再分别加入1∶1 000稀释的辣根酶(HRP)标记的羊抗兔IgG和羊抗小鼠IgG二抗室温温育2 h，TDNT洗3次，每次5 min。ECL化学发光法显色，Bio-Rad凝胶成像系统采集图片并Photoshop和UN-SCAN IT gel 6.1进行光密度分析，以表示各蛋白的相对表达量。

3 结果

3.1 油茶皂苷对多种肿瘤细胞增殖活性的影响

油茶皂苷对A549和MCF-7细胞的增殖在30～120 mg·L－1浓度范围内产生明显的剂量依赖性抑制作用。而对HepG2细胞的抑制作用浓度范围较低，为10～30 mg·L－1。对 A549、MCF-7 和 HepG2 细胞的IC50值分别为:80.41、101.45 和 24.38 mg·L－1。以上结果表明，油茶皂苷对多种肿瘤细胞均具有不同程度的剂量依赖性抑制作用，其中对人肝癌细胞株HepG2的抑制作用浓度范围最低(Tab 1)。

3.2 细胞凋亡的免疫印迹分析 MTT分析结果表明，油茶皂苷对HepG2细胞的增殖抑制作用最强，故我们后续试验均选择人肝癌细胞为研究对象，观察油茶皂苷诱导HepG2细胞凋亡情况及其可能的作用机制。

Tab 1Effect of Youchasaponin on proliferation of multitudinal cells detected by MTT assay(±s，n=4)

Tab 1Effect of Youchasaponin on proliferation of multitudinal cells detected by MTT assay(±s，n=4)

＊＊P＜0.01 vs control

Group Dose/mg·L－1 A549 livability/% Dose/mg·L－1 MCF-7 livability/% Dose/mg·L－1HepG2 livability/%Control － 100.00 ±4.19 － 100.00 ±5.22 － 100.00 ±3.67 Youchasaponin 120 26.72 ±2.39＊＊ 120 32.7 ±1.68＊＊ 30 28.11 ±4.74＊＊90 31.95 ±1.87＊＊ 90 61.75 ±1.25＊＊60 77.74 ±4.28＊＊ 20 83.63 ±3.42＊＊ 20 62.88 ±3.11＊＊30 94.14 ±2.37 30 92.52 ±1.82 15 101.23 ±3.36 15 98.93 ±1.68 10 102.16 ±9.45

Caspase级联反应在细胞凋亡过程中发挥着最重要的作用。Caspase蛋白水解酶是执行细胞凋亡作用的终末分子，PARP是激活Caspase的死亡底物，可作用于细胞核内修复受损的DNA。实验结果如Fig 1A所示，药物浓度高于10 mg·L－1油茶皂苷即可诱导procaspase-3降解，并激活CleavedPARP片段，且随着剂量的增加Cleaved PARP的表达量增加。procaspase-3的降解和Cleaved PARP表达量的增加如Fig 1B所示，与空白对照相比较差异有显著性(P＜0.05)，上述结果充分证明了油茶皂苷在10～30 mg·L－1范围内可以诱导HepG2细胞发生凋亡。

Fig 1 Effects of Youchasaponin on procaspase-3 and cleaved PARP protein in HepG2 cells

众所周知，细胞凋亡的经典途径主要有两条，一条是通过胞外信号激活细胞内的凋亡酶Caspase(称为外源性途径)、一条是通过线粒体释放凋亡酶激活因子激活Caspase(称为内源性途径)［8］。这些活化的Caspase可将细胞内的重要蛋白降解，引起细胞凋亡。近年来大量研究显示，内质网应激途径在肿瘤发生发展过程中起着关键性作用［9－12］。临床上也可通过诱导肿瘤细胞的凋亡来治疗肿瘤。为了探讨油茶皂苷诱导HepG2细胞凋亡中内质网应激感受蛋白的作用，我们继续采用 Western blot对Bip/GRP78、ATF6(activating transcription factor 6)、IRE1(inositol requiring enzyme 1)和Perk(PKR-like ER kinase;PKR:double-stranded RNA-activated protein kinase)等相关蛋白的表达情况进行分析。如图Fig 2A所示，ATF6和Perk蛋白的表达随着油茶皂苷浓度的增加呈现明显的剂量依赖性下降，其中可以认为Perk蛋白量的减少和Perk蛋白磷酸化水平的增高是同时进行的，而IRE1蛋白则表现出剂量依赖性地增加趋势。与此同时还可观察到不同浓度的油茶皂苷对HepG2细胞处理后，各组Bip蛋白的表达差异没有显著性。这说明油茶皂苷通过激活IRE1和Perk的磷酸化而触发了内质网应激介导的细胞凋亡。关于上述蛋白的表达量变化见Fig 2B。

Fig 2 Effects of Youchasaponin on Bip，ATF6，IRE1 and Perk proteins in HepG2 cells

内质网应激感受蛋白Perk在未折叠蛋白增多时可发生自身磷酸化参与未折叠蛋白的清除。Perk的活化同时导致翻译起始因子eIF2(eukaryotic initiation factor 2)的α亚基磷酸化，抑制大部分蛋白合成［13］。而蛋白质的合成是由翻译起始因子 eIF2a和延伸因子eEF2共同来决定的。既然油茶皂苷可以影响内质网3个跨膜感受蛋白的表达，同时亦可活化Perk，那么油茶皂苷是否影响到蛋白质的翻译起始因子eIF2a和延伸因子eEF2呢?为此，我们又进行了深入研究。

由Fig 3可知，油茶皂苷随着浓度的增加，即在10～30 mg·L－1范围内，翻译起始因子 eIF2a和延伸因子eEF2都被磷酸化，而且磷酸化水平存在剂量依赖性。这进一步表明油茶皂苷同时干预eIF2a和eEF2而抑制蛋白质的合成，进而通过降低内质网的功能而诱导细胞凋亡。

Fig 3 Effects of Youchasaponin on eIF2a and eEF2 proteins in HepG2 cells

4 讨论

据有关科学资料考证，茶油比橄榄油营养价值还高，为各种食用油之冠;同时含有丰富的维生素和微量元素、植物甾醇，长期食用茶油可有效改善心脑血管疾病［14－15］。正因为茶油有如此益处，2009年11月初，国务院正式颁布的《全国油茶产业发展规划(2009～2020年)》提出，到2020年，力争将茶油作为百姓的第一食用油。党中央、国务院高度重视油茶产业发展，胡锦涛总书记、温家宝总理、回良玉副总理曾多次对此作出重要批示和指示［16］。既然国家鼓励种植油茶，必将会产生大量榨出油后的茶麸，为了将茶麸变废为宝，开发其潜在的药用价值，本文从油茶皂苷诱导HepG2细胞凋亡的角度去探讨了其可能的作用机制。

众所周知，恶性肿瘤是危害人类生命健康的重大疾病，同时中草药的抗肿瘤作用也越来越得到国际社会的承认。油茶在国家政策的大力支持下资源十分丰富，而且油茶皂苷已经证明在10～30 mg·L－1范围内可以剂量依赖性地抑制人肝癌细胞HepG2的增殖。其中对 HepG2的 IC50值为24.38 mg·L－1。随后的免疫印迹显示，随着油茶皂苷作用浓度的增加，降解 procaspase-3的表达，活化PARP的裂解，其结果明显高于对照组。充分说明油茶皂苷可以诱导HepG2细胞发生凋亡。在细胞凋亡信号转导途径中，第3条内质网应激通路是当今研究热点。其中PERK、ATF6以及IRE 1信号不仅能够启动ERS的生存途径，严重或长时间的ERS损伤内质网的功能时，这3个信号通路同样能够启动由ERS所介导的凋亡信号通路，诱导细胞凋亡，以去除受损伤的细胞。然而它们并不是直接引起细胞凋亡的，而是通过激活下游的凋亡信号分子，如Caspase以及Bcl-2家族等。

基于以上实验结果，油茶皂苷是一种潜在的抗肿瘤药物，它能够有效的诱导人肝癌细胞HepG2的凋亡发生，其可能的机制之一就是通过内质网应激途径，上调IRE1和活化Perk，同时激活procaspase-3以及裂解PARP。油茶皂苷诱导肿瘤细胞凋亡的深入机制还有待于进一步研究。

［1］ 高继银.山茶属植物主要原种彩色图集［M］.浙江，浙江科学技术出版社，2005:15－16.

［1］ Gao J Y.Collected species of the Genus Camellia an illustrated outline［J］.Zhejiang，Zhejiang Sci Technol Press，2005:15 － 6.

［2］ 何新钟.对油茶的开发利用及发展的研究现代经济信息，2010，10:158－9.

［2］ He X Z.The development and utilization of Camellia oleifera A-bel.and development［J］.Mode Economic Information，2010，10:158－9.

［3］ 梁雨祥.试谈我国油茶和优质山茶油的产业化开发［J］.宏观经济研究，2006，(1):25－7.

［3］ Liang Y X.Industry development of Camellia oleifera Abel.and camellia oil［J］.Macroeconomics，2006，(1):25 － 7.

［4］ 种 伟，王新凯.我国油茶产业发展问题的初步分析［J］.中国林副特产，2010，(4):87－90.

［4］ Zhong W，Wang X K.Initial analysis of industry and development issues from Camellia oleifera Abel［J］.Forest By-Product and Speciality in China，2010，(4):87 －90.

［5］ 方 柔，李伟飞，李竹君，王 超.油茶饼粕中茶皂素的提取及其在洗涤剂中的应用初探［J］.粮油加工，2009，(10):91－3.

［5］ Fang R，Li W F，Li Z J，Wang C.Study of extracted Youchasaponins in the tea cake and the application in the detergent［J］.Cereals Oils Process，2009，(10):91 －3.

［6］ 唐 玲，李红冰，陈跃龙，等.油茶粕总皂苷的提取工艺优选［J］.时珍国医国药，2009，20(4):851.

［6］ Tang L，Li H B，Chen Y L，et al.Optimization of extraction process of total saponins from Camellia oleifera Abel［J］.Lishizhen Med Mat Med Res，2009，20(4):851.

［7］ 李红冰，唐 玲，陈跃龙，等.D101型大孔吸附树脂纯化油茶皂苷的工艺研究［J］.中国药房，2009，20(12):900－2.

［7］ Li H B，Tang L，Chen Y L，et al.Study of purification in Youchasaponin By D101 macroporous resin adsorption［J］.China Pharmacy，2009，20(12):900－2.

［8］ Krueger A，Baumann S，Krammer P H.Flice inhibitoryproteins:Regulators of death receptor mediated apoptosis［J］.Mol Cell Biol，2001，21(24):8247 －54.

［9］ Xu Y，Chiu L F，He Q Y，et al.Tubeimoside-1 exerts cytotoxicity in Hela cells through mitochondrial dysfunction and endoplasmic reticulum stress pathways［J］.J Proteome Res，2009，8(3):1585－93.

［10］ Mujcic H，Rzymski T，Rouschop K M，et al.Hypoxic activation of the unfolded protein response(UPR)induces expression of the metastasis-associated gene LAMP3［J］.Radiother Oncol，2009，92(3):450－9.

［11］Hung J Y，Hsu Y L，Ni W C，et al.Oxidative and endoplasmic reticulum stress signaling are involved in dehydrocostuslactone mediated apoptosis in human non-small cell lung cancer cells［J］.Lung Cancer，2010，68(3):355 －65.

［12］ Sun S Y，Liu X G，Zou W，et al.The farnesyl transferase inhibitor lonafarnib induces CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein-dependent expression of death receptor 5，leading to induction of apoptosis in human cancer cells［J］ .Biol Chem，2007，282(26):18800－9.

［13］ Jiang H Y，Wek R C.Phosphorylation of the alpha-subunit of the eukaryotic initiation factor-2(eIF-alpha)reduces protein synthesis and enhances apoptosis in response to proteasome inhibition［J］.J Biol Chem，2005，280:14189－202.

［14］ Matton F H，Grundy S M.Comparison oil effects of dietary SFA，MUFA.PUFA on plasma lipids in man［J］.J Lipid Res，1985，26(2):194－202.

［15］ Liao Z，Yin D，Wang W，et al.Cardioprotective effect of sasanquasaponin preconditioning via bradykinin-NO pathway in isolated rat heart［J］.Phytother Res，2009，23(8):1146 － 53.

［16］邹锡兰，吴尚清.国务院批准颁布《全国油茶产业发展规划(2009－2020年)》千亿油茶产业发展待破局［J］.中国经济周刊，2009，47:45－6.

［16］ Zou X L，Wu S Q.One hundred billion tea industry to be breaking up［J］.China Economic Weekly，2009，47:45 －6.