八肽胆囊收缩素抑制LPS诱导的RAW264.7细胞AP-1活性及IL-6表达

倪志宇，董 玫，徐之璐，文 迪，李淑瑾，丛 斌

(河北医科大学基础医学院法医学系，河北省法医学重点实验室，河北石家庄 050017)

激活蛋白-1(activator protein 1，AP-1)是重要的转录因子，在炎症发展过程中起着关键的转录调控作用［1］。研究发现，AP-1的过度活化并导致多种炎症介质的过量表达释放是引起内毒素休克(endotoxin shock，ES)、ARDS以及 MODS发生的重要机制［2－3］。

八肽胆囊收缩素(cholecystokinin octapeptide，CCK-8)属小分子肽类物质，参与调节中枢神经、内分泌、免疫等多系统机能活动。研究表明［4－6］，CCK-8具有抗ES作用，可通过一系列信号通路抑制 TNF-α、IL-1β 等多种炎症介质的表达［7－8］，从而发挥抗炎作用。但CCK-8是否通过AP-1通路调控炎症反应尚未见报道。本研究将观察CCK-8对LPS诱导RAW264.7细胞 IL-6表达及AP-1 DNA结合活性的影响，以进一步阐明CCK-8的抗炎作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 RAW264.7细胞(同济医科大学);大肠杆菌脂多糖(lipopolysaccharide E.coli 0111:B4)、CCK-8(美国Sigma公司);AP-1 Consensus Oligonucleotide、NP-40、DTT、HEPES、AMV 逆转录酶(美国Promega公司);［γ-32P］ATP(北京亚辉生物公司);苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)(美国AMRESCO公司);小鼠IL-6 ELISA Kit(法国Diaclone公司);TRIzol(美国 Invitrogen公司);Taq DNA聚合酶(上海Sangon公司)。

1.2 细胞培养及分组 RAW264.7细胞在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养，细胞生长至对数生长期时，以1×105个细胞/孔接种于24孔板(用于ELISA检测)，或调整细胞浓度为每瓶1×107细胞(用于RT-PCR及EMSA检测)，加入无血清RPMI 1640培养基及不同处理因素，孵育细胞。分组:①LPS诱导RAW264.7细胞不同时间IL-6的表达:细胞培养基中加入LPS(1 mg·L－1)，分别孵育0、3、6、12、24 h;② 不同浓度 CCK-8 对 LPS 诱导RAW264.7细胞IL-6表达及AP-1 DNA结合活性的影响:对照组:细胞培养基中加入与实验组等体积的生理盐水;LPS组:细胞培养基中加入LPS(1 mg·L－1);LPS+CCK-8组:细胞培养基中先加入CCK-8(10－10、10－8、10－6mol·L－1)，孵育 10 min 后加入LPS(1 mg·L－1);CCK-8组:细胞培养基中加入CCK-8(10－8mol·L－1)。以上各组分别孵育不同时间后检测细胞IL-6及IL-6 mRNA(24 h)的表达及AP-1 DNA结合活性(1 h)。

1.3 ELISA法检测IL-6的表达 使用ELISA试剂盒分析细胞培养上清中IL-6浓度。

1.4 RT-PCR法检测IL-6 mRNA表达 利用TR-Izol提取细胞总RNA。取4.0μg总 RNA，65℃变性5 min，经AMV逆转录酶42℃逆转录30 min，合成cDNA。取5 μl cDNA产物，依次加入10×PCR缓冲液，上、下游引物 50 pmol，dNTP 0.2 mmol·L－1，MgCl22.0 mmol·L－1，Taq DNA polymerase 1 U，以下列条件进行扩增:94℃ 3 min;94℃ 45 s;50℃ 45 s(IL-6)，55℃ 45 s(β-actin);72℃ 45 s。进行 30 次循环后进一步延伸72℃ 5 min。扩增产物经1.8%琼脂糖凝胶电泳。引物由上海生工公司合成。序列如下:IL-6(上游 5'-GAAATCGTGGAAATGAG-3'，下游 5'-TAGGTTTGCCGAGTAGA-3'，扩 增 产 物455bp)，β-actin(5'-CTGTCCCTGTATGCCTCT-3'，5'-ATGTCACGCACGATTTCC-3'，扩增产物 218 bp)。用Gel-pro凝胶分析软件对电泳谱带进行半定量分析，用任意单位(AU)表示凝胶谱带的面积×荧光强度值，各细胞因子与β-actin的AU比值代表各mRNA相对表达水平。

1.5 EMSA法检测AP-1 DNA结合活性 含有AP-1特异性识别位点［9］的双链脱氧寡核苷酸为:5'-CGCTTGATGAGTCAGCCGGAA-3'，用T4多核苷酸激酶进行末端标记［γ-32P］ATP，乙醇沉淀法纯化标记的寡核苷酸。提取细胞核蛋白。取10 μg核蛋白与同位素标记的DNA探针(3.5 pmol，3.7×105Bq)在室温下进行结合反应30 min，反应成分包括:1 mmol·L－1MgCl2，0.5 mmol·L－1EDTA，0.5 mmol·L－1DTT，50 mmol·L－1NaCl，10 mmol·L－1Tris-HCl(pH 7.5)，0.05 μg poly(dI-dC)和 4% 甘油，总体积为 10 μl。为了检测AP-1结合序列寡核苷酸的特异性，设立了阴性对照(反应体系中不加核蛋白提取物)、阳性对照、竞争性抑制结合(反应体系中加入未标记的AP-1结合序列寡核苷酸)及非竞争性抑制结合(反应体系中加入未标记的AP-2结合序列寡核苷酸)4个组。取上述DNA与核蛋白结合反应产物10 μl，加1 μl载样 buffer，混匀后经 6% 聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳缓冲液为1×TBE，电泳条件300 V，45 min，溴酚兰移动至胶的3/4处终止电泳。将凝胶置真空干胶仪上真空干燥60℃，75 min，－80℃放射自显影48 h，显影后扫描至计算机中，用Gel-Pro凝胶分析软件对电泳谱带进行半定量分析，取其面积与荧光强度的乘积代表AP-1的相对活性。

1.6 统计学分析 用SPSS统计分析软件进行统计学分析。数据用±s表示，各组均数的比较行单因素方差分析(ANOVA)，用最小显著差法(least significant difference，LSD)作两两比较。

2 结果

2.1 LPS诱导 RAW264.7细胞IL-6的表达RAW264.7细胞培养上清中IL-6含量及细胞mRNA水平随LPS刺激时间的延长而升高，于LPS刺激后24 h达到高峰，与其他时间点相比差异均有显著性(P ＜0.01，P ＜0.05)。见 Tab 1，Fig 1。

Fig 1 Expression of LPS-induced IL-6 mRNA in RAW264.7 cells for different time

Tab 1 Production of IL-6 in RAW264.7 cells induced by LPS for different time(±s，n=3)

Tab 1 Production of IL-6 in RAW264.7 cells induced by LPS for different time(±s，n=3)

△△P＜0.01 vs LPS 0 h group;＊＊P＜0.01 vs LPS 24 h group

Group IL-6/ng·L－1 IL-6 mRNA(IL-6/β-actin ratio)LPS 0 h 0.00 ±0.00 0.097 ±0.031 LPS 3 h 99.90 ±20.47△△＊＊ 0.489 ±0.182△△＊＊LPS 6 h 223.98 ±19.79△△＊＊ 0.764 ±0.046△△＊＊LPS 12 h 1109.23 ±16.37△△＊＊ 0.902 ±0.027△△＊＊LPS 24 h 2071.64 ±9.08△△ 1.157 ±0.045△△

2.2 不同浓度CCK-8对LPS诱导RAW264.7细胞IL-6表达的影响 1 mg·L－1LPS孵育RAW264.7细胞24 h，细胞上清中IL-6含量及细胞IL-6 mRNA水平明显高于对照组(P＜0.01)。10－10mol·L－1CCK-8对LPS诱导的IL-6生成无明显影响，10－8、10－6mol·L－1CCK-8 可明显抑制 LPS 诱导的 IL-6生成，和 LPS组相比抑制率分别为38.5%、67.9%(IL-6含量)及43.6%、65.6%(IL-6 mRNA)(P ＜0.01)。见 Tab 2，Fig 2。

Fig 2 Effects of CCK-8 on LPS-induced IL-6 mRNA expression in RAW264.7 cells

Tab 2Effects of CCK-8 on LPS-induced IL-1β production and AP-1 DNA-binding activity(±s，n=3)

Tab 2Effects of CCK-8 on LPS-induced IL-1β production and AP-1 DNA-binding activity(±s，n=3)

＊＊P＜0.01 vs control;▲▲P＜0.01 vs LPS

Group IL-6/ng·L －1 IL-6 mRNA(IL-6/β-actin ratio)AP-1 DNA-binding activity(Darea·Ddensity Control 10.62 ±4.54 0.093 ±0.015 113.27 ±4.10 LPS 2071.64 ±9.08＊＊ 1.157 ±0.031＊＊ 593.87 ±11.77＊＊LPS+CCK-8 10－10mol·L－1 2064.08 ±11.42＊＊ 1.127 ±0.032＊＊ 584.63 ±10.08＊＊LPS+CCK-8 10－8mol·L－1 1274.19 ±13.87＊＊▲▲ 0.653 ±0.031＊＊▲▲ 333.17 ±5.56＊＊▲▲LPS+CCK-8 10－6mol·L－1 665.85 ±13.87＊＊▲▲ 0.398 ±0.013＊＊▲▲ 194.87 ±5.97＊＊▲▲CCK-8 10 －8mol·L －1)16.67 ±6.93 0.083 ±0.015 101.00 ±5.41

2.3 不同剂量CCK-8对LPS诱导RAW264.7细胞AP-1 DNA结合活性的影响 对照组RAW264.7细胞核内检测到少量与特异性寡核苷酸探针结合的AP-1。1 mg·L－1LPS孵育 RAW264.7细胞1 h，细胞内AP-1活性明显高于对照组(P＜0.01)。10－10mol·L－1CCK-8对LPS诱导的AP-1活性无明显影响(P ＞0.05)。10－8、10－6mol·L－1CCK-8 浓度依赖性地抑制了LPS诱导的 AP-1活性，抑制率为43.9%和67.2%(P ＜0.01)。10－8mol·L－1CCK-8单独孵育对RAW264.7细胞AP-1活性无明显影响。用同源性寡核苷酸(含AP-1结合位点)及异源性寡核苷酸(含AP-2结合位点)作为竞争物证实了DNA-蛋白结合的特异性(Tab 2，Fig 3)。

Fig 3 Effects of CCK-8 on AP-1 DNA-binding activity in LPS-induced RAW264.7 cells

3 讨论

巨噬细胞系统是体内启动炎症介质产生的中心细胞，是调控炎症反应的主要细胞。在参与炎症反应的众多介质中，最有影响的是 TNF-α、IL-1β、IL-6等，与内毒素休克发病和死亡的关系也最为密切［8，10］。本研究发现，LPS 刺激可迅速诱导小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞IL-6及其mRNA的表达，而预先给予CCK-8可明显抑制LPS诱导的RAW264.7细胞 IL-6及其 mRNA的表达。说明CCK-8通过抑制促炎性细胞因子的表达参与机体抗炎反应过程，且CCK-8对细胞因子生成的调控作用发生在转录水平。这与本室报道CCK-8可抑制LPS诱导的大鼠 PIMs TNF-α［7］、IL-1β［8］表达的结果一致。我们前期的研究显示，LPS刺激后，可迅速诱导RAW264.7细胞 IL-1β的表达，并于 3h达到高峰［8］。与IL-6相比，IL-1β表达峰值的时间早，但增长幅度小，持续时间短;而IL-6表达峰值的时间晚，但增长幅度大，持续时间长。提示了IL-6在促炎反应中起着非常重要的作用。

在细胞内复杂的信号级联反应中，转录因子是将信号传递至靶基因的最后环节，在信号转导过程中起着十分重要的作用。已知在LPS诱导的炎症反应中，LPS与其受体CD14、TLR4结合，将LPS信号由细胞外传导至细胞内，通过一系列信号通路使NF-κB、AP-1等转录因子激活，诱导炎症介质的表达［11］。大量研究表明抑制AP-1活性可减轻炎症反应［12－13］。而且直接抑制转录因子活性而不是单纯抑制某一种炎症蛋白的表达，抗炎效果更为明显。一些抗炎药物包括糖皮质激素、阿司匹林及圈套寡核苷酸技术均从不同水平抑制或阻断AP-1活性以抑制炎症反应。本研究发现，LPS孵育RAW264.7细胞1 h，可使细胞内AP-1活性明显增高，CCK-8预孵育则浓度依赖性抑制了LPS诱导的AP-1活性，表明CCK-8对LPS诱导的AP-1活性增高具有抑制性调节作用。

有研究表明在IL-6基因非表达调控基序中含有AP-1的结合位点，说明AP-1在IL-6基因表达中起重要作用［9］。综合前期的研究成果，我们认为，CCK-8 可通过抑制信号通路中 CD14［14］、TLR4［15］、PKC［6］、p38 MAPK［8］、NF-κB［7］、AP-1 等多层次、多靶点调控TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性介质的表达，从而发挥抗炎作用。提示我们在一些急慢性炎症相关性疾病的治疗中，CCK-8可能是一种潜在有效的治疗因子。

本实验中，对LPS诱导的RAW264.7 IL-6的表达有抑制作用的CCK-8的剂量为10－8～10－6mol·L－1，属于超生理剂量，但对静息状态下的RAW264.7细胞却无明显影响。我们前期研究发现［16］，肺巨噬细胞有CCK受体表达，LPS可诱导其表达上调，且内毒素血症时肺组织CCK-8受体mRNA表达上升与减轻肺组织形态损伤有关。说明内毒素在对机体损伤的同时也启动了机体的保护机制，CCK受体表达增加可能是保护机制之一。因此LPS激活的RAW264.7细胞能够对大剂量CCK-8产生反应，而静息状态下的RAW264.7却无应答。

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