高效液相色谱法同时测定止痢宁片中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯含量

张火旺

(广东省河源市药品检验所，广东 河源 517000)

止痢宁片由穿心莲、苦木、木香3味中药组成，具有清热祛湿、行气止痛之功效，用于肠炎、痢疾等症。现行标准[1]中，只有定性方法，无含量测定方法。已有文献报道对止痢宁片中的穿心莲内酯[2]、脱水穿心莲内酯[3]分别进行了质量控制，但仅控制1种成分不能较全面地反映产品的质量。为更好地控制该药品质量，保证临床用药的安全、有效，笔者采用高效液相色谱法同时测定止痢宁片中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量，作为该产品质量控制指标之一，现报道如下。

1 仪器与试药

安捷伦1200型自动高效液相色谱仪，日本岛津UV－2450型紫外分光光度计，CP225D型电子天平，SB2200型超声处理器。甲醇(色谱纯，TEDIA);水为超纯水;穿心莲内酯对照品(批号为110797－200307)、脱水穿心莲内酯对照品(批号为 110854－200306，供含量测定用)均购自中国药品生物制品检定所，含量均为 100%;止痢宁片(市售品，批号分别为 101006，090601，090703，090901)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Hypersil C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:甲醇－水(50∶50);穿心莲内酯检测波长∶225 nm;脱水穿心莲内酯检测波长∶250 nm;流速:0.8 mL/min;进样量:10 μL。以峰面积外标法定量[4]。

2.2 溶液制备

精密称取10.25 mg经五氧化二磷干燥24 h的穿心莲内酯对照品，置100 mL量瓶中，用甲醇溶解至刻度，作为穿心莲内酯对照品贮备液;精密称取经五氧化二磷干燥24 h的脱水对照品10.10 mg，置50 mL量瓶中，用甲醇溶解至刻度，作为脱水穿心莲对照品贮备液;两种对照品贮备液均用0.45 μm滤膜滤过，即得对照品溶液。取本品20片，除去包衣，精密称定，研细(过三号筛)，精密称取适量(约相当于2片的质量)，置50 mL量瓶中，加甲醇适量，密塞，置超声仪超声30 min，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按其质量标准中处方比例同法制备不含穿心莲的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

干扰试验:分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液，按上述色谱条件进样测绘高效液相色谱图，结果两组分的出峰时间区域没有干扰峰，表明处方中其他成分和辅料对样品的测定无干扰作用(图1)。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察:精密量取穿心莲内酯对照品贮备液和脱水穿心莲内酯对照品贮备液各 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL，分别置50 mL和25 mL量瓶中，加甲醇至刻度并摇匀，分别配成穿心莲内酯对照品溶液和脱水穿心莲内酯对照品溶液，按上述色谱条件分别进样10 μL，测定峰面积。以峰面积积分值(A)为纵坐标、穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯对照品溶液质量浓度(C)为横坐标绘制标准曲线，回归方程穿心莲内酯为 A=25.555C+0.6413(r=1.0000)，脱水穿心莲内酯 A=20.234C－12.099(r=0.9998)。结果表明，穿心莲内酯与脱水穿心莲内酯的进样量分别在0.0205～0.1230μg和0.0808～0.4848μg范围内与相应的峰面积线性关系良好。

精密度试验:取同一对照品溶液，连续重复进样6次。结果峰面积的 RSD分别为1.7%和0.48%(n=6)，表明仪器精密度良好。

重复性试验:取同一批样品，精密称取6份，按样品测定方法平行测定两组分的含量。结果穿心莲内酯与脱水穿心莲内酯的RSD分别为0.73%和0.70%(n=6)，表明方法重复性好。

稳定性试验:取同一批供试品溶液，在室温放置，每隔2 h测定1次，连续测定7次。结果穿心莲内酯与脱水穿心莲内酯含量的RSD分别为0.82%和0.53%(n=7)，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

加样回收试验:精密称取穿心莲内酯对照品10.20 mg，置50 mL量瓶中，精密吸取5 mL，置20 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为穿心莲内酯对照品溶液(含穿心莲内酯0.0510 g/L);精密称取已知含量的样品(批号为101006，穿心莲内酯含量0.6250 mg/g，平均片重0.3500 g/片)适量，共6份，分别加入上述对照品溶液2，4，5 mL，按供试品溶液制备的方法操作，进样测定含量，计算回收率。结果见表1。另取2.2项下的脱水穿心莲内酯对照品溶液(含脱水穿心莲内酯0.2020 g/L)，作为脱水穿心莲内酯对照品溶液;精密称取已知含量的样品(批号为101006，脱水穿心莲内酯含量 1.1220 mg/g，平均片重 0.3500 g/片)适量，共 6 份，分别加入上述对照品溶液1，2，3 mL，按供试品溶液制备的方法操作，进样测定含量，计算回收率。结果见表1。

表1 穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯加样回收试验结果(n=6)

2.4 样品含量测定

取4批样品，按拟订的方法制备供试品溶液，进样 10 μL，记录峰面积，按外标法计算含量，结果见表2。根据 4批样品所测结果，暂定止痢宁片中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯总量定量限为1.0 mg/g。

3 讨论

在选择检测波长时，取穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯对照品适量，用甲醇为溶剂，经紫外－可见分光光度计扫描，穿心莲内酯在225 nm波长下有最大吸收，而脱水穿心莲内酯在250 nm波长有最大吸收，灵敏度高，故选225 nm作为穿心莲内酯检测波长，250 nm作为脱水穿心莲内酯检测波长。

分别超声处理样品 10，20，30，40，60 min，测得穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯含量最高的系超声处理30 min，故认为超声处理30 min基本提取完全，最终选用甲醇超声处理30 min。

曾以甲醇－水溶液(55∶45)为流动相，但样品的分离度不好，主峰形不好;用甲醇－水溶液(40∶60)为流动相时，主峰分离好，但保留时间太长，不适合作研究;而用甲醇－水溶液(50∶50)为流动相时主峰形较对称，分离效果较好。

表2 4批样品含量测定结果(mg/g，n=3)

4批样品中，不同厂家生产的批次含量相差较大，但部颁药品标准没有含量测定标准。方法学考察结果表明，所建立的方法回收率、精密度、重现性好，这样就能更好、更进一步完善止痢宁的质量标准指标。

本方法同时测定穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量，操作简便、快捷，精密度和准确度都较好。原标准无含量测定，本方法的建立，有利于更好地提高和控制药品质量。

[1]WS3－B－0703－91，中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂(第 4 册)[S].

[2]王先友，袁 琦.HPLC色谱法测定止痢宁片中穿心莲内酯含量[J].河南大学学报(医学版)，2009，28(1):11－12.

[3]单 敏，刘海静，乔蓉霞.HPLC色谱法测定止痢宁片中脱水穿心莲内酯的含量[J].陕西中医，2004，25(6):553－554.

[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:中国医药科技出版社，2010:附录29.