没食子酸对α－葡萄糖苷酶的抑制作用及其降糖机制研究＊

张海凤，董亚琳，张 琰

(1.第四军医大学唐都医院药剂科，陕西 西安 710038; 2.西安交通大学医学院第一附属医院，陕西 西安 710061)

没食子酸(gallic acid)又名五倍子酸，化学名为3，4，5－三羟基苯甲酸，是自然界分布很广的一种有机酸，主要存在于茶叶、五倍子、塔拉、没食子等植物中，具有抗肿瘤、抗HBsAg/HBeAg和杀锥虫等作用[1]。其单体或低聚体可用来防治获得性免疫缺乏综合征，其甲基化衍生物是合成抗菌、抗心血管疾病、抗癌、镇静等药物的中间体。笔者的前期研究表明，中药五倍子的水提物具有α－葡萄糖苷酶抑制作用[2]，五倍子的主要水溶性成分之一为没食子酸。本研究旨在以麦芽糖为底物，采用两种模型研究没食子酸的α－葡萄糖苷酶抑制作用及其抑制类型，并利用Caco－2细胞模型研究其对葡萄糖吸收的抑制作用，初步探讨没食子酸的降血糖机制。

1 材料与方法

1.1 材料

CO2培养箱(日本YAMATO);医用超净工作台(苏州医疗器械仪器厂);Bio－RAD Model 550型全自动酶标仪(日本);倒置显微镜(日本 Olympuse);Waters－510型高效液相色谱仪(德国 Waters)。阿卡波糖(杭州中美华东制药有限公司，批号为060401);没食子酸(中国药品生物制品检定所，批号为0831－200302)，分别用磷酸盐缓冲液(pH=7.0)配制成10 mg/L的储备液，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌待用;血糖试剂盒(上海科华东菱诊断用品有限公司，批号为20071121);麦芽糖(分析纯，汕头市光华化学厂，批号为051210)，用磷酸盐缓冲液溶解，过滤除菌，浓度为28 mmol/L;α－葡萄糖苷酶(EC3.2.1.20，东京 TLC 公司，批号为 MGI01)，用磷酸盐缓冲液溶解，过滤除菌，浓度为10 g/L。细胞Caco－2细胞来源于中科院上海细胞库。DMEM培养基(Gibco);胎牛血清(兰州民海生物制品公司);0.25%胰蛋白酶 (Sigma);5 g/L MTT溶液(Sigma);96孔培养板 (costar)。

1.2 方法

1.2.1 对酶－抑制剂模型α－葡萄糖苷酶的抑制作用[3]

设空白组、阴性对照组、阳性对照组和试验组，反应于96孔培养板上进行。空白组每孔加入磷酸盐缓冲溶液200 μL;阴性对照组先加入磷酸盐缓冲溶液和α－葡萄糖苷酶溶液各40 μL，37℃反应10 min后加入120 μL麦芽糖作为底物，37℃反应15 min;阳性对照组先加阿卡波糖溶液和α－葡萄糖苷酶溶液各40 μL，阿卡波糖终浓度为250μg/mL，其余步骤同阴性对照组;试验组先加入不同浓度没食子酸溶液和α－葡萄糖苷酶溶液各40 μL，使没食子酸的终浓度分别为250，500，1000μg/mL，其余步骤同阴性对照组。反应结束后各组均加入1 mol/L Tris－HCl 50 μL终止反应，取50 μL反应液，分别加入200 μL的血糖试剂工作液中，37℃反应30 min后在490 nm波长处测定吸光度(A值)并记录，计算抑制率及半数抑制量(IC50)。

1.2.2 抑制类型确定[4]

在质量浓度分别为0，125，250μg/mL的没食子酸溶液中，分别加入质量浓度为 3.5，7.0，14.0，28.0 mmol/L 的麦芽糖，测定酶活力，按照Lineweaver－Burk作图确定没食子酸抑制类型。

1.2.3 细胞毒性试验[5]

采用MTT法测定没食子酸对Caco－2细胞的安全质量浓度。将Caco－2细胞接种于96孔板中，每孔180 μL，密度为4×104/mL，培养24 h后，分别加入没食子酸溶液20 μL，使没食子酸终浓度分别为 100，200，250，500，750，1000μg/mL。继续培养 24 h 后，吸出培养液，每孔加入无血清培养基200 μL及MTT溶液20 μL，37℃孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养液后，每孔内加入150 μL二甲基亚砜，振动10～15 min，使结晶物充分溶解，用酶标仪于490 nm波长处测定各孔吸光度(A值)，记录结果。

1.2.4 对Caco－2细胞模型α－葡萄糖苷酶的抑制作用[6－7]

设空白组、阴性对照组、阳性对照组和试验组。Caco－2细胞接种于24孔板上(4×104个/孔)，4 d后融合，继续培养至12 d。试验前移去培养液，细胞用磷酸盐缓冲溶液洗3次，除去细胞表面的附着物。空白组每孔加入1 mL磷酸盐缓冲溶液;阴性对照组每孔加入800 μL底物和200 μL磷酸盐缓冲溶液;阳性对照组每孔加入800 μL底物和200 μL阿卡波糖溶液，使其终浓度为250μg/mL;试验组每孔加入800 μL底物和200 μL没食子酸溶液，使没食子酸终浓度为 250，500，1000μg/mL。置 37℃反应 40 min后移入冰浴，迅速吸出反应液50 μL，分别加入200 μL的血糖试剂工作液中，37℃反应30 min，在490 nm波长处测定吸光度(A值)并记录，计算抑制率及 IC50。

1.2.5 对Caco－2单层细胞模型上葡萄糖吸收的影响

试验在T5培养瓶中的单层细胞上进行。试验前移去培养液，细胞用空白磷酸盐缓冲溶液洗3次，除去细胞表面的附着物。加入含药磷酸盐缓冲溶液0.4 mL，37℃孵育10 min后加入0.55 mmol/L的葡萄糖溶液1.6mL，使五倍子终浓度分别为250，500，1000μg/mL;阳性药组给200μg/mL根皮苷。37℃培养箱中培养40 min，迅速吸出溶液，冰冷(4℃)磷酸盐缓冲溶液洗细胞3次，收集细胞，反复冻融破碎，一部分用高效液相色谱法测定细胞中葡萄糖含量[8－9]，另一部分用于测定细胞蛋白含量。

1.3 数据处理

2 结果

2.1 对微量筛选模型α－葡萄糖苷酶的抑制作用

没食子酸在以麦芽糖为底物时对α－葡萄糖苷酶有一定的抑制作用，质量浓度为 0，250，500，1000μg/mL 的没食子酸抑制率分别为 0，(20.53±19.10)% ，(48.78% ±4.84)% ，(61.79±8.23)% ，没食子酸的 IC50为 577.5μg/mL。250μg/mL 的阿卡波糖抑制率为(80.45±1.18)%。试验浓度范围内的没食子酸抑制α－葡萄糖苷酶的作用均弱于阿卡波糖。结果见图1。

图1 没食子酸的α－葡萄糖苷酶抑制作用

2.2 抑制类型确定

由Lineweaver－Burk双倒数曲线可推测，没食子酸对α－糖苷酶抑制的抑制类型为竞争性抑制，并可求得α－葡萄糖苷酶的米氏常数 Km=3.51 ×10－4mol/L。结果见图 2。

图2 没食子酸的双倒数酶动力学曲线

2.3 细胞毒性试验

质量浓度为 0，100，200，250，00，750，1000μg/mL 的没食子酸测得吸光度(A 值)分别为 0.607 ±0.095，0.594 ±0.064，0.561 ±0.048，0.547 ±0.029，0.524 ±0.044，0.523 ±0.056，0.578 ±0.030，试验组与空白组比较无显著性差异(P＞0.05)。可见，试验浓度下的没食子酸对细胞无明显的毒性。

2.4 对Caco－2细胞模型α－葡萄糖苷酶的抑制作用

没食子酸在以麦芽糖为底物时，对Caco－2细胞所表达的α－葡萄糖苷酶有一定的抑制作用，质量浓度为0，250，500，1000μg/mL的没食子酸抑制率分别为 0，(57.43±0.43)% ，(56.23 ±4.32)% ，(98.24±0.31)%;250μg/mL 的阿卡波糖对 Caco－2细胞的 α －葡萄糖苷酶抑制率达(84.08±0.44)%。结果见图3。

图3 没食子酸对Caco－2细胞的α－糖苷酶抑制作用

2.5 对Caco－2单层细胞模型上葡萄糖吸收的影响

以葡萄糖为糖源时，阳性药根皮苷通过抑制葡萄糖载体功能可显著降低葡萄糖的吸收，阿卡波糖也有此作用，试验条件下不同质量浓度没食子酸也有此作用，且呈一定的剂量依赖关系。结果见图4。

图4 没食子酸对Caco－2细胞葡萄糖摄取的影响

3 讨论

Caco－2细胞是来源于人结肠腺癌细胞克隆株，体外培养达到融合后，可自然分化为与成熟小肠细胞具有相似形态和生化特性的细胞。它具有细胞极性并紧密连接，在肠腔侧分化出的绒毛膜面含有典型的小肠微绒毛水解酶(麦芽糖酶、蔗糖酶、6－α－葡萄糖苷酶、乳糖酶、氨基肽酶N和蛋白酶C)和各种营养物质转运载体，如P－糖蛋白(P－gp)、二价金属离子转运载体等[10]。由于Caco－2细胞具有与人小肠上皮细胞相似的糖消化、吸收和葡萄糖异生相关酶，故可利用其表达的α－葡萄糖苷酶构建模型，研究五倍子水溶性成分没食子酸对α－糖苷酶的作用。试验中选择蔗糖和麦芽糖两种底物，但以蔗糖为底物时，生成的游离葡萄糖量很少，几乎无法用氧化酶法检测，故未得到有意义的结果，因此未采用蔗糖作底物。

中药五倍子在治疗糖尿病方面有着悠久的历史，笔者的前期研究表明，其水提物能很好地抑制α－葡萄糖苷酶活性[2]。五倍子水溶性成分之一为没食子酸，以4－硝基苯－α－D－吡喃葡萄糖苷(PNPG)为底物，没食子酸具有抑制α－D－葡萄糖苷酶活性的作用[6]。笔者以麦芽糖为底物进行试验也获得了类似的结果。研究中还发现，没食子酸除可抑制α－葡萄糖苷酶活性外，还可抑制葡萄糖转运载体，从而减少葡萄糖的摄取、吸收，通过多个途径发挥降糖作用，但其降糖作用和效果还有待于动物实验的验证。

在酶－抑制剂模型和Caco－2细胞模型中，同一质量浓度没食子酸的α－葡萄糖苷酶抑制率以及没食子酸的 IC50并不一致，可能与Caco－2细胞模型上表达的α－葡萄糖苷酶量有关，故要构建稳定、可靠的α－葡萄糖苷酶靶向Caco－2细胞模型筛选α－葡萄糖苷酶抑制剂，仍需要进一步探讨;也可能是没食子酸对α－葡萄糖苷酶源具有选择性。从酶源选择性的角度来看，Caco－2细胞模型表达的α－葡萄糖苷酶具有人源性，该模型上得到的结果可能更真实、可靠。

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