高效液相色谱法和化学发光酶免疫分析法测定茶碱的血药浓度

范 毅，刘 梦

(1.江苏省泰州市人民医院，江苏 泰州 225300; 2.南通大学医学院，江苏 南通 226000)

茶碱是黄嘌呤类抗支气管痉挛药，具有良好的平喘、抗炎作用，几十年来一直是治疗支气管哮喘等急、慢性肺部疾病的常用药物，但其治疗剂量与中毒剂量较接近，安全范围较窄，剂量过大或给药速度太快，易引起严重毒性反应甚至死亡，因此检测茶碱的血药浓度非常重要。其检测方法很多，常用的有高效液相色谱法和化学发光酶免疫分析法，两种方法各有优缺点[1－7]。笔者采用两种方法对茶碱进行血药浓度监测，并求出二者的相关性。

1 实验材料

1.1 仪器与试药

高效液相色谱系统(美国Waters公司)，包括2487型双通道紫外检测器、1525型二元泵、Empower色谱工作站、80－2型离心机。茶碱对照品(中国药品生物制品检定所，批号为10121－9903);甲醇(TEDIA，色谱纯);空白血浆(泰州市中心血站提供)。AXSYM化学发光酶免疫分析仪(美国雅培公司);茶碱试剂盒(TheophllineⅡReagent Pack，美国雅培公司，批号为75267q101)。

1.2 病例资料

2010年3月至2010年5月在我院病房使用氨茶碱治疗的患者共40例。其中男29例，女11例;平均年龄69岁。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

精密称取茶碱对照品适量，置10 mL量瓶中，用甲醇－水(5∶5)溶解，稀释至刻度，即得10 g/L的茶碱对照品贮备液，置4℃冰箱冷藏备用。取乙丙醇5 mL加入95 mL三氯甲烷中，混匀，即得三氯甲烷－乙丙醇(95∶5)提取液。

2.2 样品采集与处理

选择使用茶碱的患者，前臂静脉取血，达稳态血药浓度(5～7个半衰期)后，下一次用药前空腹采血3 mL，2500 r/min离心 5 min，取血清置4℃冷藏，备用。取血清样品300 μL，置15 mL离心管中，加入提取液3.4 mL，涡旋振荡2 min，3500 r/min离心10 min，取下清液 0.3 mL，置另 1 只 1.5 mL 离心管中，40 ℃ 吹干，用流动相 100 μL 溶解，涡旋，取 10 μL 进样。

2.3 高效液相色谱法

2.3.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:大连依利特Hypersil BDS C18柱(105 mm×4.6mm，5.0μm);柱温:25℃;流动相:甲醇－水(5∶5);流速:1 mL/min;检测波长:273 nm;保留时间:2.8 min;进样量:10 μL。茶碱的保留时间为 2.8 min，峰形良好，血浆对茶碱的测定无干扰，色谱图见图1。

2.3.2 方法学考察

标准曲线绘制:精密称取茶碱对照品贮备液适量，加空白血浆分别稀释成5，10，20，40，60，80μg/mL 的血浆标准溶液。取茶碱系列质量浓度的血浆标准液，按2.2项下方法处理后，取10 μL进样，以峰面积(A)对药物质量浓度(C)作线性回归，得标准曲线方程A=16688 C－14173，r=0.9998(n=5)。结果表明，茶碱质量浓度在 5.0 ～80.0μg/mL 范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验:取空白血浆加入茶碱对照品，配制成10，20，40μg/mL的血浆标准溶液，按2.2项下方法处理血浆样品后，取10 μL进样，1 d内重复测定5次，连续测定5 d，计算低、中、高3种质量浓度的日内精密度和日间精密度。结果见表1。

图1 化学发光酶免疫分析法色谱图

表1 回收率与精密度测定结果(n=5)

回收率试验:取配制质量浓度为10，20，40μg/mL的血浆标准溶液，按2.2项下方法处理后，取10 μL进样，将标准曲线测得的各质量浓度与实际质量浓度比较。结果见表1。可见，平均回收率为102.77%，RSD=2.066%。

稳定性试验:取低、中、高 3 种质量浓度(10，20，40μg/mL)的茶碱血浆标准溶液各两份，每份各3 mL，1份室温放置，1份于－20℃冷冻放置，分别于 0，2，4，8，12 h 时取样，按 2.2 项下方法操作，进样10 μL，测定峰面积，考察样品的稳定性。结果显示，茶碱血浆样品在室温和反复冻融条件下均稳定，测定时不需特殊保护处理。

2.4 化学发光酶免疫分析法

测定原理:采用微粒子固相免疫竞争法，借助化学发光基质产生光子，根据化学发光体系中光子发光强度的大小，测定微量的抗原或抗体。AXSYM分析仪在检测过程中采用全自动精确加样系统、恒温系统、试剂冷藏系统、超声波清洗系统、磁场分离系统和中心数据处理系统等，能减少实验误差，提高检测速度。

标准曲线绘制:取质量浓度为 0，2.5，5，10，20，40μg/mL 的标准液，加入专用的制备免疫分析仪标准曲线的样品杯中，放入茶碱试剂盒，运行后仪器自动进行测试和标准曲线拟合。回归方程为A=－2.7545 C+169.03，r=0.9987(n=6)。

回收率试验:取质量浓度为5，10，20μg/mL的茶碱标准液，吸取10 μL加入样品杯中，放入茶碱试剂盒进行测定，每份样品测定3次，考察方法回收率。由表1结果可见，平均回收率为101.17%，RSD=1.16% 。

2.5 两种方法测定结果比较

取患者的血样40例，同一份血样分别使用高效液相色谱法和化学发光酶免疫分析法测定血药浓度，所得结果进行相关性浓度分析，以高效液相色谱法测得的质量浓度为 X、化学发光酶免疫分析法测得的质量浓度为Y，得回归方程 Y=0.9577X+0.4938，r=0.9765。结果表明，两种方法测得的结果无显著性差异，见图2。

图2 两种方法相关性

3 讨论

本试验中两种方法各有优缺点。高效液相色谱法准确、灵敏度高，色谱峰分离比较完全，峰形与重现性都比较好，但耗时较长，适用于要求较高的药代动力学研究。化学发光酶免疫分析法需要专门的试剂盒，比较昂贵，但可同时大量地对同种药物的血药浓度进行监测，节约时间，提高工作效率。

本试验结果显示，两种方法无显著性差异，相关系数 r=0.9765，表明这两种方法有较好的相关性，测定结果无需互相校正。

[1]杨爱群，曾 佳，陈 永，等.两种测定氨茶碱血药浓度的方法的准确比较[J].解剖学研究，2008，30(1):18－20.

[2]朱立勤，姚淑娟，焦建杰，等.HPLC法测定人体茶碱血药浓度条件的筛选[J].天津医科大学学报，2005，11(1):36－38.

[3]卢协勤，张会杰.HPLC法测定茶碱血药浓度及其临床应用[J].湖北民族学院学报(医学版)，2008，25(4):18－20.

[4]洪 冰.反相高效液相法测定血清中茶碱的浓度[J].海峡药学，2009，25(5):90－91.

[5]林荣强，程海兴.90例氨茶碱血药浓度监测分析[J].中国药物应用与监测，2006(1):8－9.

[6]杨积平，裕海明.反相高效液相法测定氨茶碱血药人体浓度[J].安徽医药，2006，10(4):263－264.

[7]周美霞，陈 光，管茶英.两种方法测定茶碱血药浓度的比较[J].临床荟萃，2006，21(11):814－816.