超滤法分离提取鸡胸软骨中硫酸软骨素和Ⅱ型胶原蛋白

李燕妮

(滨州医学院药学院，山东 烟台 264003)

硫酸软骨素(CS)是关节软骨处蛋白多糖形成所必需的一类粘多糖，平均分子量为25～55 kDa，主要用于某些神经性头痛、神经痛、关节痛、偏头痛、动脉粥样硬化以及由链霉素引起的听觉障碍及肝炎的辅助治疗。实验表明，口服硫酸软骨素可以逐步缓解关节变性病症状，减少对非甾体类抗炎药(NSAIDs)的依赖[1]。通常认为硫酸软骨素是通过提高内源性合成和防止酶降解关节粘多糖来改善关节功能。

风湿性关节炎是人体常见的自身免疫性疾病，其病因是T细胞对关节软骨的抗原反应所致。而Ⅱ型胶原蛋白是关节软骨中的主要蛋白，因而是潜在的自身抗原。鸡Ⅱ型胶原蛋白具有类似的抗原型，口服后能诱导T细胞产生免疫耐受，从而抑制T细胞介导的自身免疫性疾病。口服小剂量鸡Ⅱ型胶原蛋白可缓解风湿性关节炎病人疼痛、僵直等症状[2]。

鸡胸软骨中富含硫酸软骨素和纯度较高的Ⅱ型胶原蛋白[3]，与牛的气管软骨和鲨鱼软骨相比，去除鸡胸肉后的鸡胸软骨非常容易收集。作者在此先用木瓜蛋白酶处理鸡胸软骨，然后采用超滤技术分离提取硫酸软骨素和Ⅱ型胶原蛋白[4～6]。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

鸡胸软骨。

木瓜蛋白酶(Papain)；硫酸软骨素标准品，中国药品生物制品检定所；其它试剂均为分析纯。

高速冷冻离心机，德国Heraeus公司；Minimate TFF system型超滤机，英国PALL公司；7550型紫外可见分光光度计，惠普上海仪器有限公司。

1.2 方法

超滤法分离提取鸡胸软骨中硫酸软骨素和Ⅱ型胶原蛋白的工艺流程如图1所示。

图1 超滤法提取鸡胸软骨中硫酸软骨素和Ⅱ型胶原蛋白的工艺流程

1.2.1 鸡胸软骨的水解

取1 kg冷冻后的鲜鸡胸软骨，匀浆后加入5000 mL纯化水，调pH值至7.5～8.0，加入4.0 g(相当于鸡胸软骨质量的0.4%)木瓜蛋白酶于50℃水解6 h，调节pH值至6.0，85℃灭活10 min，水解液离心，过滤，澄清。

1.2.2 硫酸软骨素的分离提取

鸡胸软骨水解液在超滤前需进行预处理以去除不溶杂质，降低超滤膜受损的风险。由于硫酸软骨素的分子量为20～30 kDa，所以本实验先用0.45 μm微孔滤膜澄清水解液，再分别选用截留分子量为8 kDa、10 kDa和30 kDa的超滤膜分离纯化硫酸软骨素，比较硫酸软骨素收率和超滤时间，以确定分离提取硫酸软骨素的超滤膜规格。

1.2.3 Ⅱ型胶原蛋白的分离提取

水解后的Ⅱ型胶原蛋白产物为分子量为1～5 kDa的多肽，所以超滤后的透过液即为分离得到的Ⅱ型胶原蛋白，选用截留分子量为0.6 kDa、1 kDa和3 kDa的超滤膜分离提取Ⅱ型胶原蛋白，比较Ⅱ型胶原蛋白收率和超滤时间，以确定分离提取Ⅱ型胶原蛋白的超滤膜规格。

1.3 分析方法

硫酸软骨素含量采用CPC(十六烷基氯化吡啶)滴定法测定；蛋白质含量采用福林酚法测定；无机盐含量采用灼烧残渣法测定。

2 结果与讨论

2.1 鸡胸软骨的主要成分

将鲜鸡胸软骨充分水解后，分别用CPC滴定法、福林酚法和灼烧残渣法测定硫酸软骨素、Ⅱ型胶原蛋白和无机盐的含量，依次为5.2%、5.1%、2.5%。

2.2 超滤工艺的确定

合适的超滤膜可以在最大程度截留处理对象(这里指硫酸软骨素)的同时，将尽可能多的杂质分开。超滤膜截留分子量较小，会实现更高的收率，但膜通量也会有所下降，从而延长了处理时间。因此，膜通量和选择性是两个相互矛盾的参数，必须综合考察膜通量和选择性，以选择最适合的膜组件。

2.2.1 硫酸软骨素的分离提取

取澄清后的鸡胸软骨水解液分成等体积的3份，控制超滤膜进口压力为0.3 MPa、温度为10℃，在回流液中补加纯化水，等体积(保持回流液总量不变)超滤至透过液电导率低于600 μS·cm-1时，比较3种规格超滤膜对硫酸软骨素的收率和超滤时间，结果见表1。

由表1可见，采用截留分子量为8 kDa和10 kDa的超滤膜分离提取硫酸软骨素，收率较高，30 kDa的超滤膜则有部分透过。但由于截留分子量为8 kDa的超滤膜耗时较长，并且由于截留分子量小，对较大分子量杂质的除去效果不如10 kDa的超滤膜。因此，选择截留分子量为10 kDa的超滤膜分离提取硫酸软骨素，收率达97.1%。

表1 提取硫酸软骨素用超滤膜的选择

超滤可以分离除去大部分的无机盐和小分子肽，并通过检测透过液电导率反映除去效果。随着超滤时间的延长，回流液中蛋白质或肽含量逐渐降低；但即使无时间限制地超滤下去，最终还是有大约20%(以软骨总蛋白质质量计)的蛋白质留在了10 kDa超滤膜的浓缩液里。这是因为木瓜蛋白酶水解后的硫酸软骨素通常仍带有1～5个氨基酸残基，故超滤不能完全去除硫酸软骨素中的蛋白质。

2.2.2 Ⅱ型胶原蛋白的分离提取

取超滤后的透过液分成等体积的3份，控制超滤膜进口压力为0.6 MPa、温度为10℃，在回流液中补加纯化水，等体积超滤至透过液电导率低于200 μS·cm-1后，比较3种规格超滤膜对Ⅱ型胶原蛋白的收率和超滤时间，结果见表2。

表2 提取Ⅱ型胶原蛋白用超滤膜的选择

由表2可见，采用截留分子量为0.6 kDa、1 kDa和3 kDa的超滤膜分离提取Ⅱ型胶原蛋白，收率依次降低，但没有显著差异，由于截留分子量为3 kDa的超滤膜耗时最短，因此，选择截留分子量为3 kDa的超滤膜分离提取Ⅱ型胶原蛋白，收率达95.1%。

3 结论

以鸡胸软骨为原料，用木瓜蛋白酶处理鸡胸软骨以实现高效率的水解，水解液用截留分子量为10 kDa的超滤膜，在0.3 MPa、10℃分离提取硫酸软骨素，收率达97.1%；超滤透过液用截留分子量为3 kDa的超滤膜，在0.6 MPa、10℃分离提取Ⅱ型胶原蛋白，收率达95.1%。超滤技术可以实现常温分离和浓缩，能耗低，回收率高，操作简单易行，易于工业化生产。

[1] Weiner H L. Oral tolerance：Immune mechanisms and treatment of autoimmune diseases[J]. Immunology Today，1997，18(7)：335-343.

[2] Cho So Yean，Sim Joon-Soo，Jeong Choon Sik，et al. Effects of low molecular weight chondroitin sulfate on type Ⅱ collagen-induced arthritis in DBA/1J mice[J]. Biol Pharm Bull，2004，27(1)：47-51.

[3] Luo X M，Fosmire G J，Leach R M. Chicken keel cartilage as a source of chondroitin sulfate[J]. Poultry Science，2002，81(7)：1086-1089.

[4] 李燕妮.超滤法分离纯化刺参酸性粘多糖工艺研究[J].化学与生物工程，2009，26(1)：39-41.

[5] 纪存朋，于建生，黄淑燕.膜系统在生物技术中应用的研究进展[J].化学工业与工程技术，2009，30(5)：24-28.

[6] 姜玉红，张翊.硫酸软骨素含量测定的法定方法[J].食品与药品，2009，11(3)：68-70.