重症肌无力患者外周血T淋巴细胞亚群分布特点及临床意义

2011-07-23陈玉萍魏东宁

医学研究生学报 2011年9期

陈玉萍，魏东宁，肖漓

0 引言

MG是乙酰胆碱受体抗体介导的自身免疫性疾病，细胞免疫和补体参与其发病机制。细胞免疫紊乱是MG发病的重要原因之一。正常情况下，机体外周血中CD4+/CD8+T细胞比值相对稳定。当T细胞亚群的数量和功能异常时，机体免疫功能紊乱并导致一系列病理变化。研究已证实MG患者外周血T淋巴细胞亚群异常，表现为CD8+T细胞百分比下降，导致CD4+/CD8+比值升高［1］。胸腺切除术及激素治疗 MG通过调整T淋巴细胞亚群异常，恢复正常T细胞免疫而发挥治疗作用的［2］。因此 T淋巴细胞在 MG的发生、发展及治疗过程中起重要作用。本文研究了112例不同年龄、性别、临床分型MG患者外周血T淋巴细胞亚群分布特点，分析药物和手术治疗的MG的转归与T淋巴细胞亚群异常的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象 112例MG患者为我院神经内科重症肌无力治疗中心2008年1月至2010年1月的住院患者，均根据典型病史、临床体征、新斯的明试验、重复电刺激及胸部CT检查而确诊。其中男女性各56例，年龄3～77岁，平均(35.5±18.4)岁。病程0.5月～21年，其中1年以下70例，1年以上42例。按Osserman临床分型，Ⅰ型(单纯眼肌型)40 例(35.7%);Ⅱ型(全身型)69 例(61.6%)，其中ⅡA(轻度全身型)20例，ⅡB(中度全身型)49例;Ⅲ型(急性重症型)3例(3.7%)。所有患者采血前6个月内未使用免疫抑制剂。健康人对照组为我院体检者，共50例，年龄5～80岁，平均(37.2±19.4)岁。年龄、性别与MG组比较无统计学差异。

1.2 治疗情况 112例MG患者中单用溴吡斯的明片治疗者50例，溴吡斯的明片+醋酸泼尼松片者22例，接受扩大胸腺切除者40例。

1.3 外周血T、B淋巴细胞测定用流式细胞仪(FACSCalibur)进行外周血B淋巴细胞亚群的测定。所有MG患者入院第2天抽血检测T、B淋巴细胞水平。采用Follicol法制备外周血单核细胞悬液。PBS重悬细胞后分装，每管100μl。然后分别加入FITC-CD3、PE-CD8、Percp-CD45、APC-CD4 荧光标记的单克隆抗体各10μl，另以未加抗体者作为阴性对照、荧光标记的同型抗体作为同型对照。室温避光孵育20 min，用红细胞裂解液裂解红细胞10 min，1500 r/min离心5 min，离心半径10 cm，2 ml PBS洗涤1次，重新悬浮细胞至200μl，上流式细胞仪检测。流式细胞仪为FACSCalibur，应用Cell Quest软件进行细胞计数和结果分析。

1.4 随访及疗效评定 112例患者治疗后接受门诊、电话进行疗效的随访，观察治疗后服药情况及症状的变化。随访时间为3～14个月，平均9个月。疗效评定依照Monden标准［3］。A:症状缓解，不用药物、无症状或遗留轻微症状，能胜任日常工作和生活);B:改善，降低药物剂量或临床症状减轻;C:无变化，临床症状无改变;D:恶化，药物用量增加或症状加重，包括死亡。A和B为治疗有效预后良好，C和D为预后不良。

1.5 统计学处理采用SPSS 13.0软件进行数据统计分析，结果用均数±标准差(±s)表示，定量资料两组间比较采用独立样本t检验;多组间比较采用单因素多水平方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MG患者外周血T淋巴细胞亚群的分布特点

2.1.1 比较MG患者组与正常对照组外周T淋巴细胞亚群分布特点与健康人对照组相比，MG患者外周血CD8+T细胞百分比明显降低(P＜0.01)，CD4+/CD8+比值异常升高(P ＜0.05)，而 CD4+T细胞百分比在2组间无差异，见表1。提示MG患者体内存在T淋巴细胞亚群分布异常。

表1 MG患者组与正常对照组外周CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群百分比及CD4+/CD8+比值Table 1 Distribution of CD4+and CD8+T cell subsets and the ratio of CD4+/CD8+in the peripheral blood of MG patients and controls(s)

组别 n CD4+(%) CD8+(%) CD4+/CD8+50 39.92 ±8.07 26.01 ±5.34 1.54 ±0.52 MG 患者组 112 41.29 ±6.69 22.54 ±4.51 1.92 ±0.56 t－0.89 4.65 －3.09 P健康人对照组0.38 0.000 0.002

2.1.2 不同年龄、性别、临床分型MG患者外周T淋巴细胞亚群分布特点的比较不同性别和临床分型MG患者外周血T细胞亚群分布无明显差异。但随年龄增加，MG患者体内CD4+/CD8+比值升高，不同年龄组外周血CD4+T细胞百分比差异显著，见表2。提示MG患者体内T淋巴细胞亚群分布异常随年龄而逐渐明显。

表2 不同年龄、临床分型MG患者组外周CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群百分比及CD4+/CD8+比值Table 2 Distribution of CD4+and CD8+T cell subsets and the ratio of CD4+/CD8+in the peripheral blood of MG patients of different age and clinical stages(s)

组别 n CD4+(%) CD8+(%)CD4+/CD8+≤14 25 38.36 ±5.70 23.32 ±4.18 1.69 ±0.35年龄(岁) 15 ～49 64 42.22 ±6.27 22.94 ±4.29 1.92 ±0.52≥50 23 41.43 ±7.56 20.57 ±5.09 2.15 ±0.74 F 3.29 2.92 4.33 P 0.04 0.06 0.02临床分型 Ⅰ 40 39.98±5.70 22.10±4.85 1.91±0.56ⅡA 20 40.00 ±6.44 21.65 ±4.42 1.96 ±0.63ⅡB 49 42.53 ±7.23 23.16 ±4.20 1.90 ±0.55Ⅲ 3 42.00 ±7.90 24.00 ±6.20 2.00 ±0.20 F 2.12 0.80 0.07 P 0.10 0.50 0.98

2.2 T淋巴细胞亚群异常与药物和手术治疗疗效的关系在除外年龄、性别、临床分型及治疗措施对预后影响的基础上，分析患者治疗前外周血T淋巴细胞亚群与经胆碱酯酶抑制剂、糖皮质激素及胸腺扩大切除术后预后的关系。从表3可见，仅服用胆碱酯酶抑制剂患者预后与治疗前外周血T细胞亚群百分比无关。而激素组和手术组预后良好者外周血CD8+T细胞百分比明显低于预后不良者(P＜0.01)、CD4+/CD8+比值明显高于预后不良者(P＜0.05)，提示术前外周血T淋巴细胞亚群异常可能影响糖皮质激素及胸腺扩大切除术预后。

表3 用药物或手术治疗不同预后的MG患者外周T淋巴细胞亚群百分比(s)Table 3 Correlation between the distribution of CD4+and CD8+T cell subsets and prognosis of MG after medication or thymectomy(s)

组别预后 n CD4+(%) CD8+(%)CD4+/CD8+A+B 30 38.84 ±7.25 24.35 ±6.62 1.75 ±0.70 C+D 20 40.65 ±7.84 24.85 ±6.64 1.75 ±0.57 t 0.77 0.07 0.00 P 0.39 0.79 1.00激素组 A+B 15 40.00 ±7.94 26.32 ±5.33 1.63 ±0.65 C+D 7 36.38 ±6.32 33.50 ±7.58 1.12 ±0.27 t 1.31 7.95 4.45 P 0.26 0.01 0.05手术组 A+B 30 39.40 ±7.36 26.10 ±6.66 1.60 ±0.57 C+D 10 38.04 ±8.95 30.74 ±9.02 1.32 ±0.62 t 0.60 7.70 5.50 P溴吡斯的明组0.44 0.01 0.02

3 讨论

MG是以乙酰胆碱受体抗体为主要抗体的自身免疫性疾病，虽然致病性免疫球蛋白是由B细胞分泌的，但其发病过程依赖调节性T细胞及其细胞因子的参与。临床针对B细胞的一系列治疗策略并未取得进展［4］。大量的研究侧重于T细胞，尤其是调节性T细胞及其细胞因子［5－6］。现已发现调整MG患者细胞免疫紊乱，其临床症状可得到明显改善［7］。因此针对T细胞的免疫学研究是目前重症肌无力研究的热点［8］。

正常机体的调节性T淋巴细胞可分为辅助性和抑制性亚群，其中CD8+为抑制性T细胞，CD4+为辅助性T细胞。两者互相制约，维持机体的免疫平衡，已有报道，T淋巴细胞亚群失衡与自身免疫性的疾病(如原发性干燥综合征)的关系［9］。本研究表明MG患者体内存在T淋巴细胞亚群分布异常，其异常主要为CD8+数量的减少，CD4+/CD8+比值异常升高，而CD4+百分比无明显变化。这与李作孝等［1］报道的结果一致。虽然CD4+T细胞在MG中的作用近来也受到广泛关注［5，10－11］，并证实 MG患者胸腺中存在表达有Vβ5.1受体链的CD4+T细胞，能直接识别并作用于B细胞，产生乙酰胆碱受体抗体。但进一步的研究发现胸腺中表达Vβ5.1 CD4+T细胞的MG患者的外周血中Vβ5.1 CD4+T细胞数量并无增加［11］，提示 CD4+T细胞参与 MG的发生与其数量无关，主要是由于其其功能的改变。本研究也发现MG患者外周血CD4+T细胞百分比与健康人对照组相比无明显差异，其功能是否有改变尚有待进一步确定。CD8+T细胞为抑制性T细胞，其如何参与MG的发生目前尚存在争议。一部分研究者认为CD8+T细胞主要发挥调节作用，而在实验获得性MG的研究模型上证实其也参与MG形成的病理过程［12］。本研究发现MG患者体内CD8+抑制性T细胞数量的减少，使其抑制功能下降。虽然CD4+辅助性T细胞数量无明显变化，但可能CD4+T辅助细胞功能亢进，促进B细胞异常增殖，产生针对自身抗原乙酰胆碱的自身抗体，从而诱发MG的发生。

进一步分析发现随MG患者年龄的增加其T淋巴细胞亚群异常逐渐明显，而与性别、临床分型无关。一方面随着年龄的增加，机体细胞免疫功能下降。刘学员等［13］研究发现与正常对照组相比，老年人外周血CD4+/CD8+比值升高，与本文的结果一致。另一方面MG患者胸腺瘤的发生率随年龄的增加而增高，而胸腺瘤合并MG患者胸腺组织本身内成熟的CD8+T细胞减少，存在T淋巴细胞亚群的异常［14］，使得外周血中细胞免疫紊乱更加明显。以上两方面因素导致老年MG患者中T淋巴细胞亚群异常更为明显。本文结果还表明T淋巴细胞亚群异常与临床分型无关，这与文献报道不尽一致，有报道［2，6］认为MG患者病情加重时，CD8+百分比下降，CD4+/CD8+比值升高;而病情缓解时CD8+百分比升高，CD4+/CD8+比值下降。不同临床分型的MG患者病情严重程度与T细胞亚群数量异常的严重程度并不平行，可能更决定于T细胞亚群功能异常。研究也证实眼肌型和全身型MG患者外周血CD4+T细胞对乙酰胆碱受体的反应不同，提示不同临床类型MG患者体内CD4+T细胞功能存在差异［15］。

此外本研究结果表明治疗前患者T细胞亚群紊乱明显者，即CD8+百分比下降、CD4+/CD8+比值升高明显者，经糖皮质激素及胸腺扩大切除术疗效较好。此结果间接证实糖皮质激素及胸腺扩大切除术通过调整细胞免疫功能紊乱而发挥治疗MG作用。这与文献报道激素或胸腺手术治疗后MG患者外周血CD4+、CD8+T细胞百分比及CD4+/CD8+比值恢复正常［16］，以及胸腺切除术后甲状腺功能紊乱得到纠正相一致［17］。另一方面，此结果也提示治疗前T细胞亚群紊乱明显的患者，其细胞免疫紊乱在MG发病中占主导作用，细胞免疫紊乱逐渐得到纠正后，其临床症状明显改善。因此检测外周血T淋巴细胞亚群百分比对于指导临床治疗、判断预后有重要意义。

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