丹参酮ⅡA对腹膜透析患者基质金属蛋白酶-2及金属蛋白酶组织抑制剂-1的影响

孙 琤，张 苗，蒋春明

0 引 言

PD是终末期肾病患者常用的替代治疗方法之一。但长期PD后腹膜会发生纤维化，导致透析效能下降［1－2］。MMP-2及 TIMP-1失衡可导致细胞外基质沉积，是组织纤维化包括腹膜组织纤维化发生发展的重要机制之一［3－4］。近年来的研究表明，丹参酮ⅡA对多种细胞具有抑制MMP-2和增强TIMP-1表达的作用，但其在PD相关纤维化的作用尚无研究报道。本文首先通过体外实验观察丹参酮ⅡA对人腹膜间皮细胞增殖活性及其表达MMP-2、TIMP-1的影响，并在临床上观察PDS中添加丹参酮ⅡA对腹腔局部MMP-2及TIMP-1的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 2.5%Baxter PDS为广州百特医疗用品公司产品;丹参酮ⅡA注射液为上海第一生化药业有限公司产品，规格10mg/支;磷酸盐缓冲液(PBS)、胎牛血清(FBS)、RPMI1640粉剂以及胰蛋白酶等购自GIBCO公司;抗细胞角蛋白抗体、抗波形蛋白抗体、第八因子抗体和抗白细胞CD45抗体购自北京中山生物技术有限公司;完全培养基为含20%FBS和105U/L青霉素及100 pg/ml链霉素的RPMI1640培养液;MMP-2、TIMP-1 ELISA检测试剂盒购自上海普林斯顿生物科技发展有限公司;四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲亚砜(DMSO)为Sigma公司产品;全自动酶标仪(Sunrise)为Biobank公司产品;RT-PCR试剂盒购自 Takara公司;MMP-2、TIMP-1和β-actin引物购自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 人腹膜间皮细胞的分离、培养与鉴定 取6例非尿毒症和非糖尿病择期手术患者的网膜作为间皮细胞来源，按文献［5］方法培养人腹膜间皮细胞。当细胞生长融合成单层时，用0.25%胰蛋白酶——0.02%EDTA 消化，按 1∶3 传代，第 3 代用于实验。传代细胞经倒置显微镜观察和免疫组化抗细胞角蛋白抗体、抗波形蛋白抗体染色阳性，抗第八因子抗体和抗白细胞CD45抗体染色阴性鉴定证实。

1.2.2 MMP-2、TIMP-1及细胞增殖活力检测 用含20%FBS的RPMI1640培养液，将第2代消化细胞重悬成1×105/ml的细胞悬液，置96孔培养板培养，每孔200μl，当细胞融合度达到80%左右时，用含0.1%FBS的RPMI1640培养液同步24 h后分5组观察，每组设2复孔。对照组为加入RPMI l640与完全培养基各100μl，PDS组为加入PDS与完全培养基各100μl;丹参酮ⅡA 1mg/L组、丹参酮ⅡA 5 mg/L组、丹参酮ⅡA 10 mg/L组分别含丹参酮ⅡA的PDS与完全培养液各100μl，丹参酮ⅡA终浓度分别为1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L;37 ℃，5%CO2培养48 h后上清液－20℃保存，按ELISA试剂盒说明检测MMP-2、TIMP-1。完全培养基100μl和浓度为5 mg/ml的MTT 100μl加入培养孔中继续孵育3 h，弃上清液，每孔加入 DMSO 200μl震荡混匀，取100μl加入96孔板，在492 nm处测吸光度(A)值，以A值表示人腹膜间皮细胞活性。

1.2.3 半定量RT-PCR 使用T75培养瓶进行细胞培养，分组同1.2.2，丹参酮ⅡA干预48 h后收集培养细胞，Trizol法抽提RNA。3μl总RNA进行逆转录合成cDNA。引物序列见表1。PCR循环参数:95℃预变性30 s，95℃ 30 s，62℃ 90 s，72℃ 1min，共30个循环，72℃延伸4 min。取扩增产物10μl，在TAE缓冲液中行1.0%琼脂糖凝胶(含5 g/l溴化乙锭)电泳。应用全自动图像分析系统对电泳图像进行A值扫描，以β-actin条带为内参照，计算MMP-2、TIMP-l mRNA的相对表达量。

1.2.4 临床试验 自2008年6月起，对置管透析3～6个月的38例患者进行为期6周的前瞻性观察，其中男23例，女15例，年龄28～83岁，平均年龄(52.6±14.3)岁。原发病包括慢性肾小球肾炎17例，高血压肾小动脉硬化15例，梗阻性肾病3例，痛风性肾病、多囊肾、不明原因各1例。所有参与患者均签署知情同意书。将38例患者随机分成实验组和对照组，每组19例。入组条件包括;①无糖尿病、肿瘤、系统性血管炎等全身性疾病病史;②无长期吸烟史;③观察期前1个月未发生腹膜炎、其他显性感染及心力衰竭等并发症。排除标准包括:①观察期内发生腹膜炎、其他显性感染及心力衰竭等并发症;②观察期内出现药物种类或药物剂量调整。观察方案为:第1天用2.5%Baxter PDS，留取4 h透出液1管，于30 min内分离上清液(3000×g离心10 min)，置－70℃冰箱冻存，2周内使用ELISA法检测透出液MMP-2、TIMP-1的含量。其后3周，实验组患者给予含丹参酮ⅡA注射液(10 mg/2L)的1.5%Baxter PDS，行标准持续非卧床PD(2 L×4次交换/d)治疗;对照组不给药。第3周末重复检测上述指标;随后3周，2组患者均不给药，在第6周末重复检测上述指标。

1.3 统计学分析 用SPSS 18.0软件进行统计学分析。定量资料用均数±标准差±s)表示，组内自身前后比较用配对t检验，组间比较用单因素方差分析，两两组间比较采用SNK检验。以P≤0.05为差异有显著性统计学意义。

2 结 果

2.1 体外实验

2.1.1 人腹膜间皮细胞增殖活性的改变 培养的人腹膜间皮细胞经PDS干预后，其MTT还原能力(A值)显著低于对照组(P＜0.01)。再经丹参酮ⅡA干预后，丹参酮ⅡA 1 mg/L组、5 mg/L组、10 mg/L组人腹膜间皮细胞MTT还原能力(A值)显著高于PDS组(P＜0.05)。丹参酮ⅡA 1 mg/L组、5 mg/L组、10 mg/L组组间比较，丹参酮ⅡA 5 mg/L组人腹膜间皮细胞增殖活性显著高于丹参酮ⅡA 1 mg/L组(P＜0.05)，丹参酮ⅡA 10 mg/L组显著高于丹参酮ⅡA 5 mg/L组(P＜0.05)。结果见表2。

表1 MMP-2、TIMP-1、β-actin引物序列及PCR反应条件Table 1 Primer sequences and PCR conditions of MMP-2，TIMP-1 and β-actin

表2 不同剂量丹参酮ⅡA对人腹膜间皮细胞产生MMP-2、TIMP-1及增殖活性的影响(s)Table 2 Effects of TanshinoneⅡA on cell proliferation activity and secretion of MMP-2 and TIMP-1 of HPMCs(s)

表2 不同剂量丹参酮ⅡA对人腹膜间皮细胞产生MMP-2、TIMP-1及增殖活性的影响(s)Table 2 Effects of TanshinoneⅡA on cell proliferation activity and secretion of MMP-2 and TIMP-1 of HPMCs(s)

与对照组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与 PDS组比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01;与丹参酮ⅡA 1 mg/L 组比较，△P ＜0.05;与丹参酮ⅡA 5 mg/L组比较，▲P ＜0.05

组 别 n MMP-2(ng/ml) TIMP-1(ng/ml) MMP-2/TIMP-1 61.4 ±23.4 22.2 ±14.6 4.07 ±2.61 PDS 组 6 139 ±44.9* 27.5 ±19.2 7.17 ±3.13*丹参酮ⅡA 1mg/L 组 6 130 ±39.5## 38.5 ±20.7 3.95 ±1.27#丹参酮ⅡA 5 mg/L 组 6 113±28.0##△ 40.8±21.4 3.34 ±1.30##△丹参酮ⅡA 10 mg/L 组 6 106±27.8##▲ 43.4±22.2#△▲ 2.89 ±1.18##▲对照组6 A值0.39 ±0.09 0.18 ±0.07＊＊0.30 ±0.07##0.35 ±0.08##△0.37 ±0.08##▲

2.1.2 人腹膜间皮细胞产生MMP-2、TIMP-1的变化 培养的人腹膜间皮细胞经PDS及丹参酮ⅡA使用后，上清液中 MMP-2、TIMP-1的含量及MMP-2/TIMP-1比值的变化见表2。PDS组上清液MMP-2含量较对照组明显增高(P＜0.05)，TIMP-1含量无明显变化，MMP-2/TIMP-1比值明显增加(P＜0.05);添加丹参酮ⅡA干预后的丹参酮ⅡA 1 mg/L组、5 mg/L组、10 mg/L组 MMP-2含量显著低于PDS组(P＜0.01)，丹参酮ⅡA 10 mg/L组TIMP-1含量显著高于 PDS组(P＜0.05)，MMP-2/TIMP-1比值显著低于PDS组(P＜0.05)。丹参酮ⅡA 1 mg/L组、5 mg/L组、10 mg/L组组间比较，丹参酮ⅡA 5 mg/L组MMP-2显著低于丹参酮ⅡA 1 mg/L组(P＜0.05)，丹参酮ⅡA 10 mg/L组显著低于丹参酮ⅡA 5 mg/L组(P＜0.05);丹参酮ⅡA 10 mg/L组TIMP-1显著高于丹参酮ⅡA 1 mg/L组、5 mg/L组(P ＜0.05);丹参酮ⅡA 5 mg/L组MMP-2/TIMP-1比值显著低于丹参酮ⅡA 1 mg/L组(P＜0.05)，丹参酮ⅡA 10 mg/L组显著低于丹参酮ⅡA 5 mg/L组(P＜0.05)。

2.1.3 人腹膜间皮细胞 MMP-2、TIMP-1 mRNA的表达 与对照组比较，PDS组人腹膜间皮细胞MMP-2/β-actin mRNA 和 TIMP-1/β-actin mRNA 分别上升(2.36 ±0.60)倍(P ＜0.01)和(1.13 ±0.10)倍(P ＞0.05);与 PDS组相比，丹参酮ⅡA 1 mg/L组、5 mg/L组、10 mg/L组人腹膜间皮细胞MMP-2/β-actin mRNA表达水平均显著下调(P＜0.01)，TIMP-1/β-actin mRNA 表达水平均有显著上调(P ＜ 0.05)。结果见图1、图2。

2.2 临床观察 2组患者观察期前后透出液MMP-2、TIMP-1结果见表3。实验组患者用药3周后，透出液MMP-2较用药前明显降低(P＜0.05)，透出液TIMP-1无明显变化(P＞0.05)，停药3周后，透出液MMP-2较用药3周后明显升高(P＜0.05)，透出液TIMP-1无明显变化(P＞0.05);对照组患者观察期前后透出液MMP-2、TIMP-1均无明显变化(P＞0.05)。实验组患者用药过程中未出现皮肤发红、瘙痒、肝功能异常、血细胞减少等不良反应［6］。

图1 人腹膜间皮细胞MMP-2、TIMP-1 m RNA的表达Figure 1 Expressions of MMP-2 and TIMP-1 m RNA in different groups

图2 人腹膜间皮细胞表达MMP-2、TIMP-1 m RNA的相对半定量分析Figure 2 Sem i-quantification of MMP-2 and TIMP-1 m RNA in HPMCs

表3 实验组和对照组患者透出液MMP-2、TIMP-1的变化(s)Table 3 Changes of MMP-2 and TIMP-1 in the effluent of the experimental and control groups(±s)

表3 实验组和对照组患者透出液MMP-2、TIMP-1的变化(s)Table 3 Changes of MMP-2 and TIMP-1 in the effluent of the experimental and control groups(±s)

与同组第1天比较，*P＜0.05;与同组第3周末比较，#P＜0.05

组 别 MMP-2(ng/ml)TIMP-1(ng/ml)周末对照组 51.8 ±24.5 50.9 ±23.6 51.2 ±25.5 52.3 ±25.4 51.第1天 第3周末 第6周末 第1天 第3周末 第6 5 ±24.3 53.3 ±26.7实验组 122.8 ±45.1 112.9 ±47.1* 119.5 ±45.8#122.0 ±49.8 123.7 ±49.2 125.4 ±48.5

近年来研究证实，抑制MMP-2的活性可阻止腹膜结构和功能变化，并促使腹膜结构和功能的好转。Ro等［12］发现，使用MMP拮抗剂ONO-4817可防止高糖腹透液引起的腹膜增厚、间皮下致密层新生血管的形成及巨噬细胞的浸润等。Nishina等［13］使用中性 pH腹膜透析液降低了透出液MMP-2水平，避免腹膜超滤失败。本研究通过体外实验观察到，在人腹膜间皮细胞培养液+PDS中再添加丹参酮ⅡA后，与PDS组比较，其上清液中MMP-2明显减少，MMP-2/TIMP-1比值显著降低，人腹膜间皮细胞表达MMP-2 mRNA显著下调，且随着丹参酮ⅡA浓度的升高，这种改善程度愈加明显。此外，还观察到人腹膜间皮细胞表达TIMP-1 mRNA显著上调，并与丹参酮ⅡA浓度也呈量效关系。提示丹参酮ⅡA具有下调人腹膜间皮细胞MMP-2 mRNA表达、上调TIMP-1 mRNA表达，从而抑制PDS刺激间皮细胞产生MMP-2的作用，调节MMP-2/TIMP-1的平衡。进一步的体内研究显示，实验组腹腔使用丹参酮ⅡA3周后，透出液MMP-2明显降低，而透出液TIMP-1无明显变化，再经过3周的洗脱期后，透出液MMP-2又有明显升高，并恢复至用药前的水平;而对照组在整个观察期前后透出液MMP-2、TIMP-1水平均无明显变化。提示在PDS中添加丹参酮ⅡA可显著降低PD患者腹腔内高MMP-2状态。使用丹参酮ⅡA过程中，实验组无明显不良反应发生，证实其在腹腔内应用是安全可行的。

本研究结果还显示，在PDS组，其间皮细胞增殖活性较对照组显著降低，证实传统PDS可抑制人腹膜间皮细胞的增殖活性。随着在PDS中添加丹参酮ⅡA干预后，人腹膜间皮细胞增殖活性得到明显改善，且改善程度呈现明显的剂量依赖性，提示丹参酮ⅡA可拮抗PDS对人腹膜间皮细胞增殖活性的抑制作用，起到保护人腹膜间皮细胞的

3 讨 论

PD作为一种主要的终末期肾病患者肾替代治疗方法在临床上广泛应用，而生物不相容的传统PDS引起腹膜组织损伤、过度重塑、腹膜增厚及硬化是腹膜功能衰竭、透析技术性失败的病理学特征［2］。众多研究发现，MMP/TIMP在上述过程中起关键作用，其中MMP-2作为一种明胶酶，可降解构成基底膜成分的胶原蛋白Ⅳ、纤维连接蛋白等细胞外基质，并可促进新生血管的生成、致纤维化细胞的迁移等［3］;TIMP-1则可抑制MMP-2造成的细胞外基质降解，维持与MMP-2的动态平衡。伴随着腹腔内高水平的MMP-2及TIMP-1，腹膜循序渐进地出现炎症、纤维性增厚等变化，最终导致硬化。因而，调节MMP/TIMP的平衡可能给减轻腹膜损伤、抑制重塑、延缓腹膜硬化的发生带来益处。丹参酮ⅡA为丹参提取物，也是丹参有效的药理成分之一，具有许多独特的药理作用［7］，近年来又被许多基础研究证实，具有抑制多种细胞表达MMP-2 以及增加 TIMP-1 表达等作用［8－10］。因此，通过在体外培养条件下向培养液中添加不同浓度的丹参酮ⅡA，观察其对人腹膜间皮细胞MMP-2、TIMP-1产生的影响，并通过在PD患者腹腔内使用丹参酮ⅡA，了解其对腹腔内 MMP-2、TIMP-1的影响。

PDS中高糖、低pH及高温消毒过程中产生的葡萄糖降解产物，可诱导腹膜固有细胞包括间皮细胞 MMP-2及 TIMP-1的表达［11］。本研究亦证实，通过向人腹膜间皮细胞培养液中添加PDS后，与对照组比较，其上清液中MMP-2的含量显著升高，MMP-2/TIMP-1比值明显增加，人腹膜间皮细胞表达MMP-2 mRNA显著上调，提示PDS具有刺激人腹膜间皮细胞产生MMP-2的作用，并通过调节MMP-2/TIMP-1的平衡，参与腹膜损伤的过程。作用。

综上所述，丹参酮ⅡA可通过影响人腹膜间皮细胞MMP-2、TIMP-1 mRNA的表达，调节MMP-2/TIMP-1平衡，改善腹膜间皮细胞的增殖活性，显著降低PD患者腹腔内高MMP-2状态，起到潜在的保护腹膜间皮细胞和拮抗腹膜硬化的作用。

［1］Coester AM，Smit W，Struijk DG，et al.Peritoneal function in clinical practice:the importance of follow-up and its measurement in patients.Recommendations for patient information and measurement of peritoneal function［J］.NDT Plus，2009，2(2):104-110.

［2］Schmidt DW，Flessner MF.Pathogenesis and treatment of encapsulating peritoneal sclerosis:Basic and translational research［J］.Perit Dial Int，2008，28(Suppl 5):S10-S15.

［3］Hirahara I，Inoue M，Okuda K，et al.The potential of matrix metalloproteinase-2 as a marker of peritoneal injury，increased solute transport，or progression to encapsulating peritoneal sclerosis during peritoneal dialysis-a multicentre study in Japan［J］.Nephrol Dial Transplant，2007，22(2):560-567.

［4］Hirahara I，Inoue M，Umino T，et al.Matrix metalloproteinase levels in the drained dialysate reflect the peritoneal solute transport rate:A multicentre study in Japan［J］.Nephrol Dial Transplant，2011，26(5):1695-1701.

［5］Stylianou E，Jenner LA，Davies M，et al.Isolation，culture and characterization of human peritoneal mesothelial cells［J］.Kidney Int，1990，37(6):1563-1570.

［6］曹晓梅，陈小铭，孙维林.丹参酮ⅡA磺酸钠注射液的安全性评价［J］.医学研究生学报，2010，23(5):474-476.

［7］黄 珮.腹膜透析液添加丹参酮对大鼠氧化应激状态的影响［J］.医学研究生学报，2010，23(8):818-821.

［8］蒋 平，陈 鸣，吕 军，等.丹参酮ⅡA对阿尔茨海默病模型大鼠海马MMP-2、iNOS表达及自由基释放的影响［J］.第二军医大学学报，2010，31(4):380-384.

［9］杨东威，孟 彪，高立珍，等.丹参酮Ⅱa对佐剂性关节炎大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α水平及滑膜MMP3/TIMP1表达的影响［J］.实用中西医结合临床，2007，7(6):6-7，12.

［10］Fang ZY，Lin R，Yuan BX，et al.TanshinoneⅡA downregulates the CD40 expression and decreases MMP-2 activity on atherosclerosis induced by high fatty diet in rabbit［J］.J Ethnopharmacol，2008，115(2):217-222.

［11］Hirahara I，Kusano E，Yanagiba S，et al.Peritoneal injury by methylglyoxal in peritoneal dialysis［J］.Perit Dial Int，2006，26(3):380-392.

［12］Ro Y，Hamada C，Inaba M，et al.Inhibitory effects of matrix metalloproteinase inhibitor ONO-4817 on morphological alterations in chlorhexidine gluconate-induced peritoneal sclerosis rats［J］.Nephrol Dial Transplant，2007，22(10):2838-2848.

［13］Nishina M，Endoh M，Suzuki D，et al.Neutral-pH peritoneal dialysis solution improvesperitoneal function and decreases matrix metalloproteinase-2(MMP-2)in patients undergoing continuous ambulatory peritoneal dialysis(CAPD)［J］.Clin Exp Nephrol，2004，8(4):339-343.