吡格列酮对早期糖尿病肾病大鼠血清一氧化氮和一氧化氮合酶的影响

杨前勇，聂 忠，宋宁燕

0 引 言

DN是糖尿病的严重并发症和主要死亡原因［1－2］。近年来研究表明，NO、NOS活性的改变是导致DN的重要机制之一［3－4］。噻唑烷二酮类药物(Thiazolidinediones，TZDs)是一种新型胰岛素增敏剂，其对DN的保护已为一系列临床与实验研究所证实，其确切的保护机制尚未明了［5］。本研究拟从NO、NOS的角度，探讨吡格列酮对DN的防治作用及机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 链脲佐菌素(德国 Boehringer-Manmheim公司)，吡格列酮原药，考马斯亮蓝试剂、NO、NOS检测试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供，其他仪器主要有金属代谢笼、紫外可见分光光度计(美国 Beckman公司)、低温离心机(德国 Eppendorf公司)、血糖仪及试纸(美国 SureStep稳步系列)。

1.2 动物及分组 健康雄性Wistar大鼠(由第二军医大学动物实验中心提供)，平均体重(235±10)g，饲养于第二军医大学药学院清洁级动物房，12 h明暗交替光下饲养，自由进食和饮水，动物合格证号:SCXK-(沪)2006-0029。随机分为正常对照组、正常对照治疗组、糖尿病组，糖尿病治疗组，每组10只。

1.3 糖尿病模型建立及给药 将链脲佐菌素溶于pH4.5的柠檬酸缓冲液中，按55 mg/kg一次性腹腔内注射，3 d后采用血糖仪测定尾静脉全血血糖，以血糖≥16.7 mmol/L为糖尿病模型构建成功的标准。两治疗组以吡格列酮10 mg/(kg·d)(混悬于羧甲基纤维素钠溶液中)灌胃，其余2组给予等剂量溶媒灌胃。

1.4 标本收集与检测 第10周末用代谢笼准确收集24 h尿标本，记录尿量后取4 ml，2000 r/min离心10 min，离心半径10 cm，去除沉渣并于－20℃冰箱保存待测。尿蛋白用考马斯亮蓝法检测。留尿后麻醉大鼠，摘眼球取血，取大鼠肾称重，计算肾重/体重。每周用血糖仪及试纸测定空腹时尾静脉血糖。

1.5 血清NO含量及NOS活性测定(带分型) 大鼠麻醉后取血，按试剂盒要求分离血清，－20℃冰箱保存待测。测定NO含量，T-NOS、iNOS和cNOS活性，以上操作严格按照试剂说明书进行。

1.6 统计学分析 应用SPSS 11.0软件包进行统计分析，计量资料用均数±标准差±s)表示，组间比较若满足正态性且方差齐时采用单因素方差分析，两两组间比较用LSD法，方差不齐时两两组间比较选择Tamhane’s T2法。P≤0.05认为有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠血糖、体重、肾重、肾重/体重和24 h尿蛋白定量变化比较 与正常对照组比较，糖尿病组血糖、肾重/体重和24 h尿蛋白定量明显升高。与糖尿病组比较，糖尿病治疗组血糖无显著差异，但肾重/体重和24 h尿蛋白定量明显降低。正常对照组与正常对照治疗组比较差异无统计学意义。见表1。

2.2 各组大鼠血清 NO水平和 T-NOS、iNOS、cNOS活性变化比较 与正常对照组比较，糖尿病组NO水平和T-NOS、iNOS活性明显增加。与糖尿病组比较，糖尿病治疗组NO水平和T-NOS、iNOS活性明显下降。cNOS活性各组间比较差异无统计学意义。见表2。

表1 各组大鼠血糖、体重、肾重、肾重/体重与24 h尿蛋白定量的变化±s)Table 1 Changes in blood glucose，body weight，kidney weight，kidney weight index and 24h urinary protein content of the animals studied(±s)

表1 各组大鼠血糖、体重、肾重、肾重/体重与24 h尿蛋白定量的变化±s)Table 1 Changes in blood glucose，body weight，kidney weight，kidney weight index and 24h urinary protein content of the animals studied(±s)

与正常对照组比较，*P＜0.01;与正常对照治疗组比较，△P＜0.01;与糖尿病组比较，▲P＜0.01

组 别 n 血糖(mmol/L) 体重(g) 肾重(g) 肾重/体重(‰) 24h尿蛋白(mg/d)正常对照组 10 5.07 ±0.32 363.20 ±25.22 1.08 ±0.06 2.98 ±0.13 4.56 ±0.33正常对照治疗组 10 5.28 ±0.20 375.10 ±22.73 1.08 ±0.08 2.89 ±0.11 4.50 ±0.29糖尿病组 10 21.73 ±3.08＊△ 206.40±15.66＊△ 1.29±0.07＊△ 6.27 ±0.38＊△ 18.47±2.16＊△糖尿病治疗组 10 20.90±1.78＊△ 220.70±18.19＊△ 1.13±0.11▲ 5.12±0.35＊△▲ 5.53±0.70▲

表2 各组大鼠血清NO水平和T-NOS、iNOS、cNOS活性变化(s)Table 2 Changes of the NO level and T-NOS，iNOS and cNOS activities in the serum of the animals studied(s)

表2 各组大鼠血清NO水平和T-NOS、iNOS、cNOS活性变化(s)Table 2 Changes of the NO level and T-NOS，iNOS and cNOS activities in the serum of the animals studied(s)

与正常对照组比较，*P ＜0.01;与正常对照治疗组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;与糖尿病组比较，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01

组 别 n NO(μmol/L) T-NOS(U/L) iNOS(U/L) cNOS(U/L)正常对照组 10 16.02 ±1.59 18.56 ±1.01 2.78 ±0.21 15.78 ±0.98正常对照治疗组 10 15.56 ±1.47 18.76 ±1.65 2.86 ±0.12 15.90 ±1.67糖尿病组 10 54.25±2.97＊△△ 20.11±0.82＊△ 4.03±0.15＊△△ 16.08 ±0.78糖尿病治疗组 10 43.71±3.38＊△△▲▲ 18.79±1.07▲ 3.06±0.25＊△▲▲15.73 ±1.03

3 讨 论

DN早期以肾小球高滤过和高灌注、肾小球肥大、系膜区扩张、基膜增厚，晚期肾小球毛细血管腔闭塞、硬化为特征［3］。本实验结束时，糖尿病模型组大鼠肾重/体重、24 h尿蛋白含量明显增加，说明已出现了明显的肾小球高滤过和肾肥大，DN尚处于早期。而吡格列酮治疗组上述异常明显减轻，表明吡格列酮对糖尿病大鼠肾有保护作用，能减轻肾小球高滤过和肾肥大，降低尿蛋白，延缓DN的进展。

N0是肾血流动力学调节的重要因子。其在DN中的作用较为复杂，一般认为糖尿病早期NO产成增加，介导肾小球高滤过，是启动DN的重要因素，而在晚期，多种原因导致的NO的减少则为加速肾小球硬化的因素［3］。出入球小动脉对NO敏感性不同，局部产生的NO只控制入球小动脉的阻力和超滤系数，而出球小动脉对NO不甚敏感，故局部大量生成的NO强力舒张入球小动脉而出球小动脉舒张甚弱，致使肾小球内压升高，肾小球高滤过形成［6－7］。另外过多的NO还可增加球管反馈机制，这亦参与了肾高灌注、高滤过的形成［8］。

NO合成以左旋精氨酸(L-Arg)和O2为底物，NOS为氧化酶催化而产生。NOS家族有2类:cNOS和iNOS。cNOS包括神经元型NOS(nNOS)和内皮型NOS(eNOS)2种，均需Ca2+和钙调素激活，iNOS的活化则不需要Ca2+和钙调素作为协同因子。在肾eNOS主要存在于血管内皮细胞，而nNOS主要存在于致密斑细胞［9］，两者在正常生理条件下可催化少量的NO，参与肾血流量及水盐代谢调节。而iNOS在生理条件下基因不表达，但在炎症等病理条件下，如脂多糖、肿瘤坏死因子、干扰素、白细胞介素-1等细胞因子和细菌产物可诱导巨噬细胞、内皮细胞、成纤维细胞、血管内皮平滑肌细胞等iNOS高表达。陈燕铭等［10］报道糖尿病大鼠(链脲佐菌素50 mg/kg单次腹腔制备)12周时血清、尿液、肾组织中NO含量和肾iNOS的合成较正常组大鼠升高，并且与肾小球平均体积和基膜平均厚度呈正相关。

过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)与 NO的关系己引起较多关注，多数学者认为激活PPARγ后iNOS表达被抑制，NO水平降低，从而可抑制NO介导的炎症反应。体外实验表明，激活PPARγ可以抑制白细胞介素-1或脂多糖等诱导的单核-巨噬细胞［11－13］、呼吸道上皮细胞［14］、软骨细胞［15］的 iNOS过表达。体内实验也证实，PPARγ配体抑制消化道溃疡［16］、类风湿关节炎［17］中 NO介导的炎症反应，起到保护作用。另外，Reilly等［18］的研究也发现，PPARγ的配体能够抑制体外培养肾小球系膜细胞iNOS的过表达。肾小球系膜细胞有类巨噬细胞功能，通过合成NO和前列腺素等调节炎症和免疫过程。由于DN发病过程伴随炎症反应，如DN肾间质可存在淋巴细胞、单核细胞和多形核白细胞浸润等病理变化。因此吡格列酮对DN的保护作用还可能与抑制NO介导的炎症损伤有关。另外，抑制NO对于改善DN早期肾小球高滤过也有积极意义。由于NO在DN发病中的作用具有复杂的两面性，因此对于PPARγ在DN中对NO的影响应从不同时期分别研究，以进一步明确两者的关系。本实验吡格列酮治疗组大鼠iNOS活性和NO含量较糖尿病组明显降低，cNOS水平两组间比较无显著变化，表明吡格列酮可能是一种较为特异的iNOS抑制剂，能降低早期糖尿病大鼠血清NO水平，从而一定程度上减轻糖尿病大鼠肾高滤过和肾肥大，改善肾结构和功能。另外，本研究发现，吡格列酮治疗组与糖尿病组大鼠间血糖无明显差异，这表明吡格列酮不能纠正胰岛素缺乏大鼠的糖代谢紊乱，它对糖尿病大鼠的肾保护作用与血糖水平无关。

吡格列酮治疗能使早期糖尿病大鼠血清iNOS活性和NO水平降低，这可能是其纠正糖尿病早期肾血流动力学紊乱、减轻肾肥大、降低蛋白尿、改善肾功能的作用机制之一。

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