人自身抗原U1RNP 70K的酵母重组分泌表达及斑点免疫金渗滤检测法的建立

杨湘越，张惠菊，徐秀云，兰小鹏，朱忠勇

0 引 言

混合性结缔组织病(mixed connective tissue disease，MCTD)是自身免疫性疾病的一种，临床表现较复杂，可同时具有系统性红斑狼疮、系统性硬化症、多发性肌炎、皮肌炎等疾病的表现，其诊断重要依据之一是血清中存在着高滴度的抗U1RNP抗体［1］。抗U1RNP抗体由抗U1RNP-70K抗体、抗U1RNP-A抗体和抗U1RNP-C抗体组成，3者可同时出现，也可单独出现。有研究者发现几乎所有MCTD患者早期都会出现抗U1RNP 70K抗体［2］。由于其靶抗原70K U1RNP蛋白的编码基因GC含量高达70%以上，用普通Taq酶难以一步克隆。沈南等［3－4］将其分为2段分别克隆后再拼接成为完整的编码基因，可在大肠杆菌中成功表达U1RNP 70K融合抗原。但原核系统在抗原的表达量、活性、包涵体变复性、纯化、融合蛋白切割处理等方面存在诸多问题。我们采用大连宝生物公司针对高GC含量及复杂二级结构目的基因克隆的高保真 Taq酶，克隆人U1RNP 70K基因，在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)真核系统中实现高分泌表达并建立了简便快速的斑点免疫金渗滤检测法(dot immuogold filtration assay，DIGFA)。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料 人白血病淋巴细胞HL-60 cDNA由福建省血液病研究所陈英玉惠赠，大肠杆菌JM109、巴斯德毕赤酵母菌SMD1168(his4pep4)和酵母分泌型表达载体pPIC9k为本室保存，各种限制性内切酶、T4DNA连接酶、含GC的HS DNA聚合酶PCR扩增试剂盒、pMD18-T载体、DL2000 DNA分子标志物购自大连宝生物有限公司，蛋白分子量标准购自美国Generay Biotech上海公司，质粒抽提和DNA回收试剂盒、G418、蛋白质检测试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司，3S柱离心式酵母基因组制备试剂盒购自上海申能博彩公司，小牛血清白蛋白(BSA)、生物素、酵母氮源(yeast nitrogen base，YNB)和硝酸纤维素膜购自上海生工公司，可提取性核抗原(extractable nuclear antigens，ENA)自身抗体谱酶免疫斑点法检测试剂盒为杭州欧蒙医学实验诊断公司产品，抗-U1RNP标准血清为德国IMTEC公司产品。电穿孔仪、紫外分光光度计为美国Bio-Rad公司产品，PE 2400型PCR扩增仪为美国ABI公司产品，蛋白半干电转移装置为瑞典Pharmacia公司产品，GSG-2000凝胶图像分析系统为珠海黑马医疗仪器公司产品。培养基LB(10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取粉、10 g/L氯化钠)，LBA(LB加100μg/ml氨苄青霉素)，复合培养基YEPD(yeast extract peptone dextrose)含10 g/L酵母提取粉、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖、20 g/L琼脂，MD(minimal dextrose)含13.4 g/L YNB、0.0004 g/L 生物素、20 g/L 葡萄糖、15 g/L琼脂，BMGY含10 g/L酵母提取粉、20 g/L蛋白胨、13.4 g/L YNB、1%甘油、100 mmol/L pH 6.0 磷酸钾缓冲液、0.0004 g/L生物素，诱导分泌表达培养基BMMY自制，将BMGY中的1%甘油替换为0.5%甲醇。以U1RNP 70K基因两端序列自行设计引物，正向引物5'-CCTACGTAATGACCCAGTTCCTGCCG-3'，划线部分为SnaBⅠ酶切位点、反向引物:5'-ACGCGGCCGCTCACTCC GGCGCAGCCTC-3'，划线为 NotⅠ酶切位点，由上海英骏生物技术公司合成。

1.1.2 血清样本 患者血清共57份，均经ENA自身抗体谱酶免疫斑点试剂盒检测抗U1RNP阳性。其中MCTD患者15例，男3例，女12例，平均年龄32岁;系统性红斑狼疮(systemic lupys erythematosus，SLE)患者30例，男9例，女21例，平均年龄34岁;狼疮性肾炎患者12例，男5例，女7例，平均年龄14岁。健康体检者血清50份，男26名，女24名，平均年龄28岁。常规静脉采血，分离血清，－20℃保存。

1.2 方法

1.2.1 PCR扩增基因 HL-60细胞在5%CO2孵箱培养24～48 h，至细胞数量达106/ml收获，最大细胞数＜1×107，4000 r/min离心10 min，离心半径5 cm。弃上清液。按试剂盒说明提取总RNA，用重组小鼠白血病病毒逆转录酶(M-MuLV RT)逆转录为cDNA第一链。以HL-60 cDNA为模板扩增U1RNP 70K，PCR 反应体系条件:98℃ 10 s、56℃ 5 s、72℃90 s，30个循环。取10μl 1.0%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。

1.2.2 PCR产物的TA克隆、鉴定及测序 按试剂盒操作说明进行将胶回收后的PCR产物与pMD18-T载体连接，重组克隆质粒用Sna BⅠ和NotⅠ双酶切鉴定，由上海生工公司测序。

1.2.3 pPIC9k-U1RNP 70K的构建 抽取经酶切鉴定，测序正确的TA克隆质粒和酵母分泌型表达质粒pPIC9k用Sna BⅠ和NotⅠ双酶切后，电泳回收所需片段，定向连接，用CaCl2法将重组质粒转导入宿主菌E.coli JM109。挑取转化子，双酶切鉴定并测序。

1.2.4 pPIC9k-U1RNP 70K在毕赤酵母中的转化用SalⅠ线性化pPIC9k-U1RNP 70K，以线性化DNA电穿孔法(1300 V，25μF，200Ω)转化组氨酸合成缺陷型宿主酵母SMD1168，经组氨酸缺乏的MD平板筛选重组转化子，未重组的组氨酸缺陷型酵母宿主细胞在MD平板上不生长。用含不同浓度G418的YEPD平板从转化子中筛选G418高抗性的高拷贝转化子。

1.2.5 高拷贝转化子的PCR鉴定 按3 S柱离心式酵母基因组制备试剂盒操作说明提取高拷贝酵母转化子DNA，用PCR试剂盒扩增鉴定。

1.2.6 U1RNP 70K的诱导表达 将2株高拷贝转化子分别接种于100 m l BMGY增菌培养基中，30℃振荡过夜至吸光度(A)值600为3～6。菌液于离心半径5 cm，5000 r/min离心5min，弃上清液。沉淀重悬于25 ml BMMY诱导培养基中。30℃振荡培养，持续3 d，每天补加体积百分数为0.5%的甲醇，离心后弃沉淀，上清液经80%硫酸铵沉淀后复溶，置－20℃保存。无外源基因的空白载体pPIC9k转入宿主菌作为阴性对照，于同样条件下诱导表达。

1.2.7 SDS-PAGE 取 －20℃保存的表达产物20 μl与2×上样缓冲液等体积混和后上样，电泳后用考马斯亮蓝R250染色。

1.2.8 Western blot鉴定 用半干电转移仪将SDSPAGE凝胶上的蛋白转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭，一抗为抗U1RNP标准血清，二抗为鼠抗人的标记辣根过氧化物酶的鼠抗人抗体，用DAB、H2O2显色。

1.2.9 表达产物的纯化 表达产物经80%硫酸铵沉淀后复溶，用Sephacryl-100凝胶层析柱过滤纯化，收集并鉴定目的蛋白峰。

1.2.10 建立检测 U1RNP 抗体的 DIGFA［5］及方法学评价 将初步纯化的毕赤酵母重组人自身抗原U1RNP 70K，用 pH 7.4 PBS缓冲液溶解至浓度约0.5 g/L，取1μl点加在硝酸纤维素膜上，37℃烘干，用10 g/L BSA封闭，烘干后，装于自制的渗滤盒中。在反应孔内加100μl待检血清，待其完全渗入，滴加A试剂(金标 SPA)3滴，待渗入，再滴加 B试剂(0.01 mol/L，pH 7.4 PBS)2 滴，待渗入后观察结果。在反应孔内出现红色斑点者为抗U1RNP 70K抗体阳性，不出现红色斑点为阴性。阳性强度按红色斑点的深浅度不同以+～++++表示。如需检测抗体滴度，将血清用等渗盐水倍比稀释后再行检测。各类血清标本对用所建立的DIGFA与欧蒙酶免疫斑点法进行对比分析。

1.3 统计学分析 采用SAS 8.1软件进行，各组计数资料率的比较采用校正配对χ2检验。

2 结 果

2.1 U1RNP 70K基因的扩增 PCR产物电泳显示1条约1300 bp的扩增条带，符合1314 bp的U1RNP 70K基因序列长度，见图1。

图1 U1RNP 70K基因PCR扩增产物电泳图Figure 1 Agarose gel electrophoresis of the PCR product of U1RNP 70K

2.2 pMD18-TA克隆及pPIC9k-U1RNP 70K重组子的双酶切鉴定 经Sna BⅠ和NotⅠ双酶切后，得到长为9276和1314 bp的2条片段，分别为pPIC9k和U1RNP 70K，符合预期结果，见图2。

图2 重组质粒酶切电泳图Figure 2 Restrictive digestion analysis of pPIC9K-U1RNP 70K recombinant plasm ids

2.3 pMD18-TA克隆及pPIC9k-U1RNP 70K重组子的序列测定 测序图谱与GenBank核酸数据库公布的人U1RNP 70K基因序列(编号:NM-003089)完全一致。部分测序图谱见图3、图4。

图3 pMD18-TA-U1RNP 70K重组质粒5'端测序图Figure 3 5'sequencing of the recom blnant vector

图4 pPIC9K-U1RNP 70K重组质粒5'端测序图Figure 4 5'sequencing of the pPIC9K-U1RNP 70K recomblnant vector

2.4 高拷贝U1RNP 70K酵母重组菌的PCR鉴定酵母重组菌DNA的PCR产物经琼脂糖电泳，呈现一条特异性扩增区带，与预期片段长度(1314 bp)一致。见图5。

图5 高拷贝U1RNP 70K酵母重组菌PCR电泳图Figure 5 Agarose gel electrophoresis for PCR analysis of high copies recombinant transformants

2.5 SDS-PAGE和Western bolt分析 结果显示高拷贝阳性表达菌表达了1条相对分子质量约70 000的特异性蛋白条带，仅能被抗U1RNP标准血清识别，见图6。

图6 表达产物的SDS-PAGE和Western blot结果Figure 6 SDS-PAGE and Western blot of the recombinant protein

2.6 DIGFA 检测 与BSA阴性对照比较，初步纯化的高拷贝阳性菌表达产物的2个斑点均显红色结果，证明表达产物具有天然U1RNP 70 K蛋白的免疫原性，能被抗U1RNP阳性的患者血清识别，见图7。

图7 表达产物的DIGFA分析Figure 7 DIGFA analysis of the expression product

2.7 与欧蒙斑点法检测结果的比较 用所建立的DIGFA法检测欧蒙ENA酶斑点法抗U1RNP抗体阳性的患者血清57份，其中包括临床确诊的MCTD患者15例，SLE患者30例，狼疮性肾炎患者12例，同时检测50份健康体检者血清标本。检测结果显示，有3例SLE患者为阴性。健康体检者中有1例为阳性，可能是由于酵母重组U1RNP 70K蛋白纯化不彻底，而该受检者体内存在抗酵母抗体所致。以欧蒙ENA酶斑点法为标准，DIGFA的阳性符合率为94.74%(54/57)，阴性符合率为98.00%(49/50)，总符合率为96.26%(103/107)。采用 SAS 8.1软件进行校正配对χ2检验，显示2种方法检测结果无统计学意义显著性差异，χ2=0.250，P=0.617。见表1。

表1 2种方法检测抗U1RNP 70K抗体结果比较(n)Table 1 Comparison of two methods in detecting anti-U1RNP 70K antibodies(n)

3 讨 论

U1RNP 70K属于小核糖核蛋白家族，由437个氨基酸残基构成。该蛋白的实际分子质量约为52000，但由于其C末端尾部含有带高电荷的由精氨酸-谷氨酸/天冬氨酸和精氨酸-丝氨酸组成的重复序列结构，在SDS-PAGE中的迁移速度接近于70000，故称之为 U1RNP 70K［6］。U1RNP 抗原由U1RNA和11种蛋白组成，其中8种是所有snRNP共有的蛋白(B'、B、D1、D2、D3、E、F 和 G)，而其他 3种U1RNP-70K、U1RNP-A、U1RNP-C为U1RNP的特异性蛋白。U1RNP为复合自身抗原，除MCTD外，SLE、系统性硬化症等多种自身免疫病患者血清均可检出抗U1RNP抗体。在SLE患者中阳性率可达30%～40%，伴 Sm抗体出现或单独出现［7］。在U1RNP抗原中 U1RNP-70K、U1RNP-A、U1RNP-C能与抗U1RNP抗体发生反应，其中U1RNP 70K抗原是U1RNP抗原复合物中的特异性蛋白之一，其抗体可代替抗U1RNP抗体用于 MCTD的辅助诊断［8］。Combe 等［9］用 Western blot证实 U1RNP 70K 是MCTD的主要标志性自身抗原，可与抗U1RNP抗体特异性结合。

在外源基因的人工重组表达过程中，考虑到蛋白翻译后修饰加工等因素，人源真核基因在真核系统表达较原核系统更为适宜［10－13］。巴斯德毕赤酵母真核表达系统的表达产物在糖基化、磷酸化、二硫键空间折叠等方面已接近天然蛋白水平，尤其免疫原性明显增强，适合于表达蛋白疫苗及诊断用重组抗原［14－15］。本研究用酵母菌成功地表达人源U1RNP 70K蛋白，经初步纯化后，建立了检测抗U1RNP 70K抗体的斑点免疫金渗虑检测法，操作简便快速且结果准确，可用于临床常规检测。

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