Akt1和Akt2基因转染对人胃黏膜上皮细胞GES-1侵袭和迁移的影响*

谢甲贝 张庆瑜 康春生 韩 静 王 涛 张 洁

多数恶性肿瘤在发现时已伴有不同程度的转移，研究其侵袭和转移机制意义重大。蛋白激酶B（PKB或Akt）通路即以丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族为中心的信号传导通路，是近年来肿瘤研究的热点。作为多种信号转导通路的焦点，其通过下游通路影响肿瘤细胞多重生物学效应，调节包括侵袭和转移在内的多种细胞内进程[1-2]。Akt亚型Akt1、Akt2在肿瘤发生过程中的作用不尽相同，在不同细胞系中对侵袭和转移的影响甚至相反[2]。本研究将外源性Akt1、Akt2基因导入人胃黏膜上皮细胞GES-1中，观察并分析两者对GES-1的影响，旨在从其侵袭力和迁移方面探讨Akt1、Akt2基因导致正常胃黏膜上皮细胞恶性转化的可能性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株及质粒 GES-1购自北京百和营科技发展有限责任公司。p-LXSN质粒及含Akt1和Akt2基因全cDNA序列的p-LXSN-Akt1、p-LXSN-Akt2质粒由美国南佛罗里达大学Dr.Jin Q.Cheng惠赠。

1.1.2 主要试剂与仪器 质粒抽提、纯化试剂盒和总蛋白提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，脂质体Lipo⁃fectamineTM2000、DMEM培养液、小牛血清、抗生素G418购自北京索莱宝科技有限公司，兔抗人Akt1、Akt2、基质金属蛋白酶2（MMP-2）、抗丝状肌动蛋白（F-actin）单抗购自美国San⁃ta Cruz公司，抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（抗GAPDH）单克隆抗体、辣根过氧化酶（HRP）标记的羊抗兔IgG抗体、免疫荧光单克隆抗体FITC标记二抗均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，增强化学发光（ECL）试剂盒和化学发光检测系统购自美国Pierce公司（SuperSignal West Pico 34080）；Olympus光学显微镜为日本Nikon公司产品。

1.2 方法

1.2.1 基因转染和克隆筛选 人胃黏膜上皮细胞GES-1体外细胞株培养于含有10%的胎牛血清的DMEM完全培养液中，培养条件为湿润状态下37℃，5%CO2。当细胞生长到60%~70%融合时，参照脂质体LipofectamineTM2000说明书分别转染p-LXSN-Akt1（Akt1组）、p-LXSN-Akt2质粒（Akt2组），48 h后，换用含400 mg/L G418的完全培养基筛选，3周后选出抗性克隆株继续扩大培养，以正常未转染的GES-1细胞为对照组，以转染空载质粒p-LXSN的细胞株为空载组。

1.2.2 Western blot法检测蛋白表达 将各组细胞培养至约5×107时，按总蛋白提取试剂盒说明书分别提取各组待测细胞的总蛋白，并检测样品蛋白浓度。将各组细胞总蛋白按比例与5倍上样缓冲液混合，置100℃沸水中煮15 min。取等量蛋白样品溶液及蛋白Marker上样进行聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶电泳，然后将凝胶电转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，置于膜封闭液中封闭过夜。加入一抗为兔抗人Akt1、Akt2、MMP-2 单抗（1∶1 000），二抗为HRP标记的羊抗兔IgG抗体（1∶1 000）。用增强化学发光法（ECL）显色，化学发光检测系统检测。洗膜后GAPDH二次杂交检测作为内对照。实验重复3次。

1.2.3 Transwell体外侵袭实验 应用12孔Transwell侵袭小室进行侵袭实验。上室的聚碳酸酯膜-Matrigel（5 g/L）在37℃聚合后，在上室孔中分别准确加入各组细胞1×105个/孔（无血清培养基的单细胞悬液），下室中加入趋化因子600 μL（小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞48 h无血清的条件培养液），培养24 h。待培养时间结束后将Transwell上室的附着细胞用湿棉签擦去、苏木精染色，封片后显微镜下直接（200倍）观察穿过膜的细胞数。每张膜中央部分和周围部分各随机取3个视野，计数每个视野内的穿过8 μm微孔的细胞数。实验重复3次。

1.2.4 免疫荧光检测细胞骨架 备带有灭菌盖玻片的6孔培养板，每孔接种3×105个细胞于4 mL培养液中。24 h后取盖玻片做如下处理：4%多聚甲醛固定30 min，PBS液洗涤3次，每次10 min，加0.5%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton-X-100）处理15 min，PBS液洗涤3次，每次5 min；1%胎牛血清封闭40 min；滴加一抗anti-F-actin（1∶100）置湿盒中4℃过夜（16~24 h），PBS冲洗3次，滴加异硫氰酸荧光素（FITC）标记二抗（1%牛血清白蛋白-磷酸盐缓冲液BSA-PBS稀释），37℃湿盒内孵育2 h，50%缓冲甘油封固，在激光共聚焦显微镜下观察。实验重复3次。

1.3 统计学处理 以上实验各组都设3组平行样本，使用SPSS 16.0统计软件进行统计分析，计量资料以±s表示,采用单因素方差分析进行统计学处理，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转染Akt1和Akt2基因的GES-1细胞的筛选 p-LXSN-Akt1、p-LXSN-Akt2质粒分别转染GES-1细胞后，在G418（400 mg/L）作用下大部分细胞死亡，培养约10 d后可见剩余细胞成岛状生长，经过3周的G418抗性筛选，获得生长良好的抗性克隆；而正常未转染GES-1细胞在10 d左右完全死亡。

2.2 转染Akt1、Akt2基因的GES-1细胞蛋白的表达 与对照组和空载组相比，Akt1组中Akt1蛋白的表达水平明显升高，MMP-2蛋白表达量同步增强，差异均有统计学意义（P<0.01）；Akt2组中Akt2蛋白的表达水平较对照组和空载组亦明显升高，MMP-2蛋白表达量亦同步增强，差异均有统计学意义（P<0.01），见图1、表1。

表1 各组相应蛋白表达量及细胞穿出微孔数比较（n=3±s）

表1 各组相应蛋白表达量及细胞穿出微孔数比较（n=3±s）

**P<0.01

0.63±0.05 0.59±0.03 0.96±0.04 0.63±0.05 150.325**0.136<0.001 0.780<0.001 0.081<0.001 0.58±0.05 0.62±0.02 0.62±0.03 0.95±0.04 242.903**0.099 0.052<0.001 0.785<0.001<0.001 0.41±0.03 0.39±0.02 0.74±0.02 0.76±0.03 419.010**0.131<0.001<0.001<0.001<0.001 0.090 21.51±3.05 21.74±2.34 61.03±1.53 65.22±3.09 258.207**0.916<0.001<0.001<0.001<0.001 0.083对照组（1）空载组（2）Akt1组（3）Akt2组（4）F P（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（2）∶（3）（2）∶（4）（3）∶（4）组别 Akt1 Akt2 MMP-2穿出细胞数（个）

2.3 Transwell细胞侵袭实验 Akt1组和Akt2组平均每个视野穿出微孔细胞数分别较对照组和空载组增加，侵袭能力增强，差异有统计学意义（P<0.01）。而对照组和空载组间差异无统计学意义（P>0.05），见图2、表1。

2.4 免疫荧光检测细胞骨架 相对于空载组和对照组，Akt1组和Akt2组F-actin聚集增加，见图3。

3 讨论

恶性肿瘤的转移是影响患者生活质量和死亡的最主要原因。Akt通路与肿瘤发、生发展密切相关，在导致其生长增殖和侵袭转移方面发挥着重要作用[3]。近年来研究发现，活化的Akt1促进人类胃癌、胰腺癌、纤维肉瘤和成纤维细胞的侵袭能力[4]。降低Akt1的表达后，内皮细胞向基质蛋白的黏附及迁移能力明显降低，Akt1表达缺失的内皮细胞向纤维蛋白原及玻璃黏连蛋白的黏附能力低于野生型的内皮细胞[5]。Akt2的高表达和突变不仅在胶质瘤组织中可以检测到，而且在乳腺癌、大肠癌以及卵巢癌组织中也可以检测到。Zhang等[6]在胶质瘤细胞系LN-229中通过小干扰RNA（siRNA）技术下调Akt2基因表达后，发现胶质瘤细胞的运动黏附和侵袭能力明显降低，动物体内实验也进一步验证了这个结论。以上研究均表明Akt的亚型在肿瘤发生、转移中起到重要作用。

细胞迁移是细胞位置改变的动态过程，它是一种复杂的细胞行为，在胚胎发育、伤口愈合和肿瘤细胞侵袭等方面发挥重要作用，且贯穿于肿瘤转移的全过程。肌动蛋白是细胞骨架中微丝的主要成分，而细胞骨架是细胞运动的结构基础，它通过自身结构的动态重组实现细胞迁移，在肿瘤转移过程中发挥关键作用。Qian等[7]研究发现在鸡胚纤维细胞中活化的Akt形式（Myr-P3k）的足量表达能通过下游效应分子P70S6K1诱导肌动蛋白生成和细胞迁移。Zhang等[6]在胶质瘤细胞系LN-229中下调Akt2后，发现表皮生长因子（EGF）刺激产生的F-actin聚集减少，蛋白印迹验证MMP-9蛋白表达降低；Akt2基因可能通过增加Akt磷酸化增强蛋白（Girdin蛋白）调控细胞骨架，影响细胞黏附，促进胶质瘤侵袭和迁移。上述研究都说明Akt亚型通过下游信号传导通路调控细胞骨架，影响细胞迁移能力。

在哺乳动物细胞内，Akt的2个亚型在肿瘤转移中的作用比较复杂。研究表明，Akt1过表达可以抑制多个乳腺癌细胞系的侵袭性迁移，而应用siRNA技术沉默Akt1表达后却导致了细胞的运动和上皮细胞向间质细胞的转化，从而加剧肿瘤的转移[8]。相反，在不同乳腺癌细胞系用siRNA技术下调Akt2的表达均抑制了细胞的趋化运动和肿瘤的转移[9]。而胰腺癌细胞中Akt1和Akt2均通过上调胰岛素样生长因子-I（IGF-I）受体促进肿瘤的转移[10]。基于 Akt1，Akt2基因表达与GES-1细胞的运动、迁移的作用机制尚未明了，本研究采用脂质体法分别将含Akt1和Akt2基因全长cDNA序列的质粒转染到人胃黏膜上皮GES-1细胞，成功地建立了稳定表达Akt1及Akt2蛋白的GES-1细胞。Transwell法分析表明转染Akt1和Akt2基因的GES-1细胞侵袭能力增强，蛋白印迹显示MMP-2表达均相应升高。免疫荧光示转染Akt1和Akt2基因后细胞骨架F-actin聚集增加，从侧面反映了细胞向恶性方面转化。然而，Akt1、和Akt2基因在某些细胞系中（如胰腺癌细胞系）作用一致，在某些细胞系中（如乳腺癌细胞系）作用相反，这可能与Akt亚型的功能不同及细胞特异性有关，也可能与不同细胞类型信号传导通路异同有关，需要进一步研究探讨，期待为抑制GES-1细胞恶性转化的新方法。

[1]Brazil DP,Park J,Hemmings BA.PKB binding proteins.Getting in on the Akt[J].Cell,2002,111(3):293-303.

[2]Toker A,Yoeli-Lerner M.Akt signaling and cancer:surviving but not moving on[J].Cancer Res,2006,66(8):3963-3966.

[3]Samuels Y,Ericson K.Oncogenic PI3K and its role in cancer[J].Curr Opin Oncol,2006,18(1):77-82.

[4]Chin YR,Toker A.Function of Akt/PKB signaling to cell motility,in vasion and the tumor stroma in cancer[J].Cell Signal,2009,21(4):470-476.

[5]Somanath PR,Kandel ES,Hay N,et al.AKT1 signaling regulates inte⁃grin activation,matrix recognition and fibronectin assembly[J].J Biol Chem,2007,282(31):22964-22976.

[6]Zhang B,Gu F,She C.Reduction of Akt2 inhibits migration and inva⁃sion of glioma cells[J].Int J Cancer,2009,125(3):585-595.

[7]Qian Y,Corum L,Meng Q,et al.PI3K induced actin filament remod⁃eling through Akt and p70S6K1:implication of essential role in cell migration[J].Am J Physiol Cell Physiol,2004,286(1):C153-C163.

[8]Zhou GL,Tucker DF,Bae SS,et al.Opposing roles for Akt1 and Akt2 in Rac/Pak signaling and cell migration[J].J Biol Chem,2006,281(47):36443-36453.

[9]Wang J,Wan W,Sun R,et al.Reduction of Akt2 expression inhibits chemotaxis signal transduction in human breast cancer cells[J].Cell Signal,2008,20(6):1025-1034.

[10]Tanno S,Tanno S,Mitsuuchi Y,et al.AKT activation up-regulates in⁃sulin-like growth factor I receptor expression and promotes inva⁃siveness of human pancreatic cancer cells[J].Cancer Res,2001,61(2):589-593.