过氧化物酶体增殖激活受体γ或α在改善HepG2细胞糖代谢中的作用

宋璐璐 ，萧建中，邢小燕 ，张 敏，杨文英*

（1.北京协和医学院 研究生院，北京 100730；2.中日友好医院 内分泌与代谢病中心，北京 100029；3.北京大学医学部 研究生院，北京 100091）

过氧化物酶体增殖激活受体（peroxisome proliferator-activated receptors，PPAR）家族是一组经典的核受体，参与细胞能量代谢、炎症、增殖及分化的控制，尤其是糖脂的代谢。其中PPAR-α和PPAR-γ与代谢的关系更为密切。PPAR-γ主要在脂肪组织表达，也在肝脏、骨骼肌、胰腺及其它组织低表达[1]。主要调节脂质储存，促进糖代谢，抑制炎症及诱导脂联素的合成与分泌[2]。PPAR-α主要在脂代谢活动旺盛的组织表达，如肝脏、脂肪、肌肉等[3]，是脂肪酸氧化的调节元件，参与脂肪酸代谢的调控，增加脂肪酸线粒体摄取和β氧化的基因表达，并且促进肝脏糖原合成和酮体的生成，参与脂蛋白的组装。在心脏，PPAR-α还参与糖脂代谢转换的调控[4]。

关于PPAR-γ或PPAR-α在人肝细胞糖代谢中所扮演的角色，尚缺乏直接的证据。HepG2细胞是一种常用的肝癌细胞株，兼具肝细胞和肿瘤细胞的特征，能够表达多种肝脏特异的功能，因此被用于研究肝细胞生理或者作为肝细胞代谢研究的体外模型，也是生物人工肝的细胞源之一，本研究探讨PPAR-α和PPAR-γ受体在HepG2细胞糖代谢调节中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

WY14643，吡格列酮和棕榈酸购自美国Sigma公司；牛血清白蛋白（不含游离脂肪酸）购自德国Cabiochem公司；葡萄糖测定试剂盒（北京康泰临床检验试剂）；丙酮酸测定试剂盒和乳酸测定试剂盒 （南京建成生物科技有限公司）；Trizol（Invitrogen，美国），Real time-qPCR 试剂盒（Toyobo，日本）。WY14643和吡格列酮溶于二甲基亚砜，棕榈酸按6.8：1的比例与不含游离脂肪酸的牛血清白蛋白共轭耦合。

1.2 细胞培养

HepG2细胞在5%C02、37℃条件下培养于含10%胎牛血清、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、青霉素、链霉素和1g/L葡萄糖的DMEM培养基。细胞复苏传至第3代后进行分组实验。

1.3 葡萄糖消耗实验

以0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化细胞，将细胞悬液接种于96孔培养板，细胞生长至70%～80%密度后更换为含胰岛素（10-7M）的无血清无酚红低糖（1g/L）DMEM培养基，分别加入吡格列酮（10μM），WY14643（10μM），每组设 6 个平行孔，每孔100μl培养基，孵育24h后以葡萄糖氧化酶法测定培养基上清中葡萄糖浓度，计算绝对葡萄糖消耗量。然后每孔加入20μl MTT试剂，37℃孵育4h，DMSO充分溶解后测定吸光度，以此代表细胞活力，计算相对葡萄糖消耗量（绝对葡萄糖消耗量/细胞活力）。

1.4 胰岛素抵抗（IR）模型

IR的细胞模型建立参照文献[5]。HepG2细胞生长至50%～60%融合，更换含高浓度FFA（0.5 mmol／L）的低糖 DMEM 培养基培养24h，于4℃条件下用预冷0.01mol／L磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞3次，即成为具有IR的细胞模型，测定培养液中葡萄糖含量作为模型鉴定指标。模型建立后，分别用吡格列酮（10μM），WY14643（10μM），测定胰岛素刺激后的葡萄糖消耗量。

1.5 糖酵解产物测定

细胞种于96孔板，24h后无血清无酚红无丙酮酸钠的低糖DMEM培养基，分别加入吡格列酮（10μM），WY14643（10μM），继续孵育 24h，检测培养基中丙酮酸和乳酸含量。另外将细胞种于12孔板，每组设6个平行孔，给予药物处理24h后，以胰酶收获各瓶中全部细胞。离心，仅保留细胞沉淀，加入低渗盐溶液，使各样品细胞终浓度均为1×106／m1，反复冻融3次，用超声波振荡器处理1min，离心后保留上清，测定丙酮酸和乳酸含量。

1.6 总RNA提取和RT-qPCR

细胞种于12孔板，分别给予不同药物处理24h后，收集细胞提取总RNA。将1g总RNA，65℃变性5min，反转录得到cDNA，进行实时荧光定量PCR，检测糖酵解相关基因醛缩酶（ENO1），磷酸果糖激酶（PFKL），磷酸甘油酯激酶（PGK1）和丙酮酸激酶（PKM2）的mRNA表达。采用NCBI在线引物设计软件设计引物，序列如下：PPAR-γ正义引物5'-CAG CCA CCC ACT GTT CAT CAT-3'，反义引物5'-CGG AAT GCA CCA TGC ACT T-3'；PPAR-α 正义引物 5'-ATG GGT ATT GGT CCT GTC CCT-3'，反义引物5'-TCC TGC TTT CTT CAG TGC CC-3'；ENO1正义引物 5'-GCT CTA GCT TTG CAG TCG TG-3'，反义引物5'-TGA GGC GAG AAA AAC AAT GA-3'；PFKL 正义引物 5'-GTCCGCAGCACTCAGACTACG-3'，反义引物5'-GTT GTT GCT GAT GGT GGC TG-3'；PGK1正义引物 5'-AGC CCA CAG CTC CAT GGT AG-3'，反义引物5'-TCA AAA ACC CAC CAG CCT TCT'；PKM2 正义 引物 5'-GCCATGGCTGACACATTCCT-3'，反义引物5'-TGAATCAATGTCCAGGCGG-3'。Real-Time PCR条件：95℃ 1min，95℃ 15s，60℃ 15s，72℃ 45s，40 个 循环，以GAPDH作为内参照。

1.7 数据处理

所有数据采用SPSS11.5软件统计，组间比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 吡格列酮和WY14643对PPAR-γ或PPAR-α表达的影响

吡咯列酮组PPAR-γmRNA表达与对照组相比增加7%，无统计学差异。WY14643组PPAR-α表达轻度减低（11%），无统计学差异。

2.2 吡格列酮和WY14643均增加葡萄糖消耗

各实验组经细胞活力测定校正后，吡格列酮组HepG2细胞葡萄糖消耗量增加了150%（P＜0.01），WY14643 组增加了 20%（P＜0.05）。

图1示，IR模型组HepG2细胞葡萄糖消耗量较正常组明显减少，约为正常组的40%（P＜0.01），吡咯列酮明显增加葡萄糖的消耗，较模型组增加 1.4 倍（P＜0.01），WY14643 组葡萄糖消耗量较模型组增加 45%（P＜0.05）。

2.3 PPAR-γ对HepG2糖酵解基因表达的调控

HepG2细胞糖代谢以糖酵解途径为主，因此我们检测了4个糖酵解相关基因。图2示，吡格列酮显著上调PFKL、PGK1和PKM2的表达，分别比对照组增加7.7倍、4.5倍和4.2倍（P＜0.05）；WY14643处理组，ENO1和PKM2基因表达轻度上调，但没有统计学差异。

2.4 吡格列酮、WY14643对糖酵解的影响

图3示，吡格列酮处理后，相比空白组，培养液上清中丙酮酸水平和乳酸水平分别升高了69%和120%，细胞内丙酮酸水平和乳酸水平分别提高了72%和89%，细胞内和细胞外糖酵解产物水平变化一致。WY14643对细胞内及细胞外丙酮酸和乳酸水平均无显著影响。

3 讨论

PPAR-α和PPAR-γ拥有许多共同的靶点，也有各自独立调控的基因群。动物实验中，噻唑烷二酮增强多个靶器官的胰岛素敏感性，上调肝脏胰岛素信号转导通路的基因表达，减轻胰岛素抵抗，并减少肝糖输出。体外研究发现，HepG2表达PPAR-γ，PPAR-γ 激动剂多对 PPAR-γmRNA 的转录水平没有显著影响，与本研究的结果一致；其主要效应表现为强烈诱导PPAR-γ活化[6，7]。

本研究观察了 PPAR-α和 PPAR-γ在HepG2细胞糖代谢中扮演的角色。PPAR-α激动剂和PPAR-γ激动剂都增加HepG2细胞葡萄糖的消耗量，并且不同程度地改善游离脂肪酸诱导的胰岛素抵抗；吡格列酮部分通过上调糖酵解相关基因增加葡萄糖消耗，而WY14643并调节HepG2糖酵解。

PPAR-γ激动剂增加糖酵解产物丙酮酸和乳酸生成。糖酵解是HepG2细胞糖代谢的起点，因此直接影响其他代谢途径的调控[8]。丙酮酸和乳酸水平升高有可能有3种机制：葡萄糖摄入增加，糖酵解增强以及糖酵解利用减少。本研究中吡格列酮促进HepG2葡萄糖的消耗，Kim等[9]人报道TZDs上调原代培养的肝细胞GLUT2基因表达，增加葡萄糖的摄取。本研究检测了糖酵解相关基因的表达，发现PPAR-γ激动剂至少上调3种参与糖酵解的基因表达，表明PPAR-γ激动剂也促进HepG2细胞糖酵解。

PPAR-α主要和脂质代谢有关，动物实验发现PPAR-α激动剂能够改善胰岛素抵抗，降低血糖[10，11]，但在临床研究中没有得到同样的结果[12]。本研究表明，激动剂轻度增加HepG2细胞葡萄糖消耗，并改善胰岛素抵抗，但对糖酵解基因的诱导和糖酵解途径的激活没有作用。PPAR-α激活可能调节葡萄糖摄取或其他代谢途径，有文献报道PPAR-α激动剂GW7467促进大鼠心肌细胞葡萄糖的摄取[13]。

PPAR-γ和PPAR-α在肝细胞及心肌细胞的作用与在脂肪细胞的作用完全不同。罗格列酮对分化成熟的人脂肪细胞GLUT4表达无明显作用，对其糖摄取和糖酵解的影响也无统计学差异[4]。而PPAR-α抑制分化成熟的脂肪细胞糖酵解，减少丙酮酸和乳酸生成，抑制糖酵解相关基因的表达；抑制葡萄糖的摄取[4]。这与在HepG2细胞中得到的结果完全不同。

综上所述，本研究发现在HepG2细胞PPAR-γ和PPAR-α受体都有促进糖代谢的作用，并且可不同程度地改善棕榈酸诱导的胰岛素抵抗，其作用机制可能与增强葡萄糖摄取或糖酵解有关。关于PPAR-γ和PPAR-α在正常肝细胞糖代谢中的作用有待进一步探讨。

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