STAT2，STAT3，IL12RB2，JAK2基因与强直性脊柱炎患病风险的关联研究

张玉荣 张建佚 周 林 宋玉国 张吉林

朱小泉1 杨 帆1，2 黄慈波1 霍正浩2 杨 泽1

强直性脊柱炎属于风湿病范畴，累及多个器官、多个系统，病情复杂，致残率极高，严重影响患者的身心健康，并给个人、家庭和社会带来沉重的负担。强直性脊柱炎常见于(16～30)岁的青年人，40岁以后首次发病者少见，约占3.3%。该病的发病率国内为0.3% ～0.4%，国外总体人群发病率为0.1% ～0.2%［1］。因而强直性脊柱炎并不是一种少见的疾病，且以年轻男性多见，必须引起高度重视。对于强直性脊柱炎动物模型的研究，证明了遗传因素和环境因素共同参与了强直性脊柱炎的发病。遗传学的相关研究又表明多种炎症因子与强直性脊柱炎的发病密切相关，例如HLA27，TNF2α，MMP3，IL21等［2］。从免疫因子信号传导通路中寻找强直性脊柱炎的致病原因已经成为一种重要的研究方法。STAT2，STAT3，IL12RB2，JAK2基因存在于细胞因子IL-12通路上，IL-12通路是细胞免疫的重要因子，能调节Th1/Th2细胞免疫应答的平衡。

因此本文从细胞因子IL-12通路上选取STAT2，STAT3，IL12RB2，JAK2这4个基因，并进一步选取这些基因中的6个位点，从遗传学角度展开研究，进行这些位点与强直性脊柱炎的关联分析，以增加大家对强直性脊柱炎的了解。

1.材料与方法

1.1 材料 吉林汉族人群的48名患者来自北华大学附属医院检验中心，所有病例均经病理组织学确证。55名正常对照为来自吉林地区的无血缘关系的健康正常人群。所有研究对象采集静脉血5ml，并签署有知情同意。

1.2 方法

1.2.1 引物设计及PCR反应条件 应用HRM小扩增子法进行基因分型时，杂合型主要依据熔解曲线形状，而纯合型则是依据Tm值的不同，所以扩增片段要尽量小，这样有助于扩大纯合型样本间Tm值的差异。引物、探针序列采用Primer Premier 5.0软件及Light Scanner Primer Design software完成，高温内参与低温内参依据文献合成。各SNP基因分型所用方法、引物序列和退火温度、退火时间和延伸时间(见表1)。其中SNPrs10758669、SNPrs744166是采用PCR-RFLP方法，所用限制性内切酶分别为:BsaJI、AluI;各酶的酶切情况是338bp→288bp和50bp，247bp→218bp和29bp;其余的SNPs采用HRM-小扩增子法。限制性内切酶BsaJI、AluI的酶切温度分别为55℃、37℃，BsaJI酶切时间为3～4小时，AluI的酶切时间大约(7～8)小时。

表1 6个SNPs PCR扩增条件

1.2.2 产物测序 PCR产物送上海生工技术有限公司及北京天一辉远公司进行测序，以验证分型的准确性，做好质量控制，只列举部分SNPs测序结果说明。

1.3 统计学方法 对照人群Hardy-Weinberg平衡采用(卡方拟和优度检验。相对风险用比数比(odd ratio，OR)值及其95%可信区间(95%CI)来评价。用直接计数法计算等位基因及基因型频率，各组间基因型及等位基因频率比较采用χ2检验差异的显著性水平(检验水准为α=0.05)。用SPSS 16.0软件建立数据库完成相关统计分析。采用SHEsis进行单倍型分析。应用MDR进行基因交互作用分析。

2.结果

2.1 STAT2基因(rs2066808，C;rs2066807，G)，STAT3 基因(rs744166，C)，IL12RB2 基因(rs3790567，A;rs3790568，A)和JAK2基因(rs10758669，A)的风险等位基因及其基因型频率 以Hardy-Weinberg平衡法检验病例组与正常对照组的基因型频率的分布，除了rs2066808(P＜0.05)，其他均具有群体代表性(P＞0.05)。STAT2基因(rs2066807，G)，STAT3基因(rs744166，C)，IL12RB2 基因(rs3790567，A;vrs3790568，A)和JAK2基因(rs10758669，A)与强直性脊柱炎关联分析显示各基因的风险等位基因和基因型频率在病例组和对照组间的分布差异无显著性(P＞0.05)。

图1 SNP rs3790567 CG型测序图

图2 SNP rs3790567 GA型测序图

图3 SNP rs3790567 AA型测序图

表2 6个SNPs的风险等位基因和基因型频率

表3 单倍型分析结果

2.2 单倍型分析

2.2.1 IL12RB2基因上rs3790567，rs3790568的单倍型分析 IL12RB2基因上rs3790567，rs3790568单倍型分析的总r2为4.090，P-exact值为0.130。由表3可以看出P值均大于0.05，无统计学意义。

2.2.2 采用 MDR分析 STAT2基因(rs2066807，G)，STAT3基因(rs744166，C)，IL12RB2 基因(rs3790567，A;rs3790568，A)和JAK2基因(rs10758669，A)的5个多态性位点的交互作用 MDR分析的最佳模型包含了 rs2066807，rs3790567，rs744166，rs107586669这4个位点(如图4所示)，图中空白表明该基因型空缺。模型的P＜0.0001，交叉验证一致性为10/10，检验样本的准确度为 0.7032，结果提示STAT2，STAT3，IL12RB2和JAK2基因之间可能存在基因-基因交互作用。树状图显示rs744166和rs107586669作用比较强烈。节点图显示，只有STAT3(rs744166，C)与其他三个基因都具有协同作用，而其他三个基因都各有与其拮抗的基因。其中STAT3与JAK2基因之间距离更短，协同百分数最高，有最强的协同作用。

图4 STAT2(rs2066807)，STAT3(rs744166)，IL12RB2(rs3780567)和JAK2(rs10758669)基因交互作用

图5 STAT2(rs2066807，G)，STAT3(rs744166，C)，IL12RB2(rs3790567，A)和 JAK2(rs10758669，A)交互作用树状图、节点图

3.讨论

强直性脊柱炎是一种自身免疫性疾病，其病因未明。强直性脊柱炎的发病与多种因素相关，其中基因遗传是非常重要的因素，因此本文对细胞因子IL12通路上STAT2基因(rs2066808，C;rs2066807，G)，STAT3 基因(rs744166，C)，IL12RB2基因(rs3790567，A;rs3790568，A)和 JAK2 基因(rs10758669，A)展开研究，研究其与AS的关联性，及这些基因之间的交互作用。

IL-12是最强的促炎症因子之一，它由35kDa和40kDa的两条链构成，其中35kDa的链编码IL12A，40kDa的链编码IL12B［3］。IL12来自于外周血T细胞和自然杀伤细胞，能够直接刺激干扰素γ(IFNγ)，肿瘤坏死因子(TNFα)以及IL12的产生，提高自然杀伤细胞溶解酶的活性，促进有活性的自然杀伤细胞和T细胞(CD4+和CD8+)扩增。通过这些功能，IL12促进产生最为常见的Ⅰ型T细胞反应。通过IFNγ，IL12能够抑制血管再生［4］。J M Pe＇ron曾经临床实验性的使用IL12用来治疗肿瘤，试验的结果显示在一些病例中IL12可以使肿瘤衰退。STAT3作为JAK2的靶蛋白，正常情况下位于细胞浆内。当JA K2被激活后，信号经JAK2/STAT3通路传导，使STAT3磷酸化而活化，即p2STAT3表达增加，然后转入核内，与靶基因启动子结合，诱导基因表达，转录合成效应底物［4］。Bromberg认为STAT3在细胞的增值和生存方面扮演了重要角色［5］。有文献报道，心肌缺血缺氧及再灌注等可以作为应激原刺激多种细胞因子产生，激活JAK2，启动JAK2/STAT3信号通路，介导心肌保护作用［6～8］。然而与AS相关的报道，不是很多。

总之，AS是一个微效基因参与发病机制的多基因病。文中rs2066808位点Hardy-Weinberg平衡检验不平衡，估计是样本太少，不具有群体代表意义。STAT2基因(rs2066807，G)，STAT3 基因(rs744166，C)，IL12RB2 基因(rs3790567，A;rs3790568，A)和JAK2基因(rs10758669，A)关联分析显示各基因的风险等位基因和基因型频率在病例组和对照组间的分布差异无显著性(P＞0.05)。树状图显示 rs744166和rs107586669作用比较强烈。对于中国人群的AS研究仍然需要在一个大的样本中进一步验证。

1 熊曼琦.风湿病的中医临床诊治［M］.北京:人民卫生出版社，2006:226-229.

2 吕鸿，孙美荣.来氟米特在强直性脊柱炎中的应用.1002-7386(2011)01-0110-03.

3 Xuan YT，Guo Y，Han H，et al.An essential role of t he JA K2 STAT pat hway in ischemic preconditioning［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2001，98(16):9050-9055.

4 J M Pe＇ron，C Bureau，P Gourdy，H Lulka，et al.Treatment of experimental murine pancreatic peritoneal carcinomatosis with fibroblasts genetically modified to express IL12:a role for peritoneal innate immunity［J］.Gut 2007，56:107-114.

5 Promberg et al.Differential interleukin-6/Stat3 signaling as a function of cellular context mediates Ras-induced transformation［J］.Breast Cancer Res.2010，12(5):R80.

6 Hattori R，Maulik N，Otani H，et al.Role of STAT3 in ischemia preconditioning［J］.J Mol Cell Cardiol，2001，33(11):1929-1936.

7 Omura T，Yoshiyama M，Ishikura F，et al.Myocardial ischemia activatesthe JAK-STAT pathway through angiotensinⅡsignaling in vivomyocardium of rats［J］.J Mol Cell Cardiol，2001，33(2):307-316.

8 Xuan Y T，Guo Y，Han H，et al.An essential role of the JAK-STAT-pathway in ischemic preconditioning［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2001，98(16):9050-9055.