MBP-1分子真核表达载体的构建及其在食管癌细胞株Eca109中的高表达*

李雪婷，谢勇恩

(川北医学院病理生理学教研室，四川 南充 637007)

MBP-1，又称为c-Myc启动子结合蛋白(c-Myc promoter binding protein)，我们通过实验研究发现人食管上皮细胞在高浓度亚硝酸盐冲击诱导培养后MBP-1呈现下调表达［1］，由于MBP-1可以调控包括c-Myc在内的多个肿瘤相关基因的表达，是一个值得深入研究的调控分子。本研究构建了MBP-1分子真核表达载体并在食管癌细胞株Eca109中实现了高表达，为进一步探讨MBP-1分子高表达对食管癌细胞增殖和凋亡的影响以及以MBP-1分子为靶点的食管癌基因治疗等研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 质粒载体和细胞株

质粒载体pcDNA3.1(+)由本研究室唐恩洁教授赠送。含MBP-1基因的质粒pCMV6-XLM购自Origene公司，食管癌细胞株Eca109购自中国科学院上海细胞生物研究所。

1.2 主要试剂

PCR扩增试剂、T4噬菌体DNA连接酶、限制性内切酶HindⅢ和BamHⅠ、质粒提取试剂盒、脂质体转染试剂Lipofectin2000、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、TEMED、过硫酸铵、硝酸纤维素膜、鼠抗MBP-1单克隆抗体、兔抗β-actin单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，DAB显色试剂盒均购自晶美生物公司，其余试剂为国产或进口分析纯。

1.3 MBP-1基因的扩增

根据 GenBank中 MBP-1基因序列(GenBank accession number:GU170215)设计一对PCR引物，上游引物序列为:5'-gcaagcttatggatg gaacagaaaataaatctaag-3'，下 游 引 物 为:5'-gcggatccttacttggccaaggggtttctgaag-3'，上下游引物分别引入HindⅢ和BamHⅠ限制性内切酶位点。引物由大连宝生物科技有限公司合成。以质粒pCMV6-XLM为模板建立扩增体系，循环参数为:先94℃预变性3分钟，然后进入循环，94℃ 变性1分钟、55℃退火1分钟、72℃延伸1分钟，共30个循环，末次循环自动延伸7分钟，扩增完毕后取10μl扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并对目的条带进行胶回收纯化。

1.4 重组质粒的构建

将MBP-1基因片段和质粒载体pcDNA3.1(+)经限制性内切酶HindⅢ和BamHⅠ双酶切后，在T4噬菌体DNA连接酶作用下进行链接反应，取5μl链接液转化大肠杆菌JM109感受态细胞，取200μl转化液铺于LB平板固体培养基(含氨苄青霉素50μg/μl)，37℃孵育过夜，次日随机挑取阳性克隆接种2ml含 50μg/μl的 LB 液体培养基，37℃ 振摇培养(16-18)小时后提取质粒DNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测进行初步筛选，对重组质粒进行酶切和DNA测序鉴定。

1.5 细胞培养和转染

食管癌Eca109细胞以相同细胞数接种25cm2细胞培养瓶，置CO2孵箱培养，当细胞达90%融合时用于转染，细胞分为三组，每组3瓶细胞，第一组转染重组质粒pcDNA3.1-mbp-1，第二组转染质粒pcDNA3.1(+)，第三组不做任何处理，细胞转染按脂质体转染试剂Lipofectin2000操作说明书进行。

1.6 Western-blotting检测

转染72小时后收集细胞，每瓶细胞加入1ml蛋白裂解缓冲液，细胞裂解液置冰浴超声处理1分钟，4℃以12000转/分离心10分钟，收集上清液，采用Bradford法［2］测定各样本蛋白质含量，调节各样本的蛋白浓度使其相等。取蛋白样品各10μl，加入等量2×SDS凝胶加样缓冲液，100℃煮沸3分钟后上样进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳完毕后用BR10592型半干转移系统将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上，膜用含50g/L脱脂奶粉的TTBS封闭3小时后，依次与鼠抗MBP-1单克隆抗体、酶标二抗结合，最后用增强型DNA显色试剂盒显色，凝胶成像系统摄像，用β-actin作为内参照进行相同印迹实验，通过软件对蛋白印迹条带进行灰度值对比分析。

2 结果

2.1 重组质粒的鉴定

随机挑取转化后生长出的10个阳性菌落，接种LB液体培养基(含氨苄青霉素50μg/μl)，37℃振摇培养16小时后，用质粒提取试剂盒提取质粒，0.8%琼脂糖凝胶电泳结合紫外光灯观察发现2个分子量比载体质粒pcDNA3.1(+)大的质粒，对其中一个大分子量质粒用限制性内切酶HindⅢ和BamHⅠ双酶切1小时，0.8%琼脂糖凝胶电泳结合紫外光灯观察发现该大分子量质粒能够切下大小约为1kb的插入片段，其大小与MBP-1基因大小相符(见图1)，DNA测序表明插入片段的核苷酸序列与GenBank中MBP-1基因序列完全一致，表明重组质粒构建成功，并命名为pcDNA3.1-mbp-1。

2.2 MBP-1在食管癌细胞实现高表达

取重组质粒pcDNA3.1-mbp-1转染细胞裂解液、质粒pcDNA3.1(+)转染细胞裂解液和空白对照细胞裂解液各10μl，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移至硝酸纤维素膜，依次与一抗、二抗反应，最后显色，结果发现 MBP-1分子在质粒 pcDNA3.1(+)转染细胞和空白对照细胞表达量基本相同，MBP-1分子在重组质粒pcDNA3.1-mbp-1转染细胞表达量明显增高，其灰度值约为质粒 pcDNA3.1(+)转染细胞的2.1倍，见图2。

3 讨论

MBP-1和TATA结合蛋白均能与c-Myc基因P2启动子区的小沟特异性结合，阻止c-myc基因转录起始复合物的形成，从而负向调控c-Myc基因的表达［2，3］。目前研究发现，MBP-1 可能是一种具有多种生物学活性的转录抑制因子，可参与多个基因的转录和表达调控［4，5］。Ghosh AK 等［6］研究发现，前列腺癌细胞中高表达MBP-1可使MEK5α表达降低，这种降低可能与MEK5α的过度泛素化和经蛋白酶体降解增多有关，MEK5α表达降低会抑制MAPK信号途径的活性，使癌细胞的生长减慢。在另一项研究中，Ghosh AK等［7］还发现，MBP-1可抑制bcl-XL基因启动子活性，下调bcl-XL基因的表达，由于bcl-XL分子可阻止线粒体细胞色素C的释放，发挥抗凋亡作用，MBP-1通过下调bcl-XL分子表达可能促进细胞凋亡。

由于我们发现人食管上皮细胞在高浓度亚硝酸盐冲击诱导培养后MBP-1呈现下调表达，我们想知道MBP-1分子是否与食管癌的发生发展存在某种相关性。这就必须对MBP-1进行相关分子功能研究，可以通过基因敲除或RNA干扰技术抑制食管癌细胞MBP-1分子表达，然后观察其对癌细胞生长等生物学行为的影响，也可以人为导致MBP-1分子在食管癌细胞高表达，然后观察其对癌细胞的影响，在本研究中我们首先采用基因定向克隆技术构建了MBP-1高效真核表达载体，转染食管癌细胞后实现了MBP-1分子的高表达，在进一步研究中，我们将观察MBP-1分子的高表达对食管癌细胞增殖和凋亡的影响，同时建立荷瘤裸鼠动物模型，观察MBP-1高表达能否抑制肿瘤的生长。

总之，本研究成功构建了MBP-1分子真核表达载体并在食管癌细胞中实现了高表达，为进一步深入探讨MBP-1的分子功能并探索以MBP-1分子为靶点的食管癌基因治疗等研究奠定了基础。

［1］Xie Y，Tang E，Ren B，et al.Overexpression of S-adenosyl homocysteine hydrolase and down-regulation of prohibitin and c-Myc binding protein in the human esophageal squamous cell line HEEC exposed to N-nitrosomethyl-benzylamine［J］.Molecular Medicine Reports，2010，3(3):503 － 508

［2］Bradford MM.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram of protein utilizing the principle of protein dye binding［J］.Anal Biochem，1976，72(1):248 －254

［3］Ray R，Miller DM.Cloning and characterization of a human c-myc promoter binding Protein［J］.Mol Cell Biol，1991，11(4):2154 －2161

［4］Hsu WK，Hsieh RH，Wu CW，et al.MBP-1 suppresses growth and metastasis of gastric cancer cells through COX-2［J］.Molecular Biology of the Cell，2009，20(11):5127 －5137

［5］Steele R，Mott J，Ray RB.MBP-1 upregulates miR-29b that represses Mcl-1，collagens，and matrix-metalloproteinase-2 in prostate cancer cells［J］.Genes Cancer，2010，1(4):381 － 387

［6］Ghosh AK，Steele R，Ray RB.C-myc promoter-binding protein 1(MBP-1)regulates prostate cancer cell growth by inhibiting MAPK pathway［J］.J Biol Chem，2005，280(14):14325 － 14330

［7］Ghosh AK，Majumder M，Steele R，et al.MBP-1 mediated apoptosis involves cytochrome c release from mitochondria［J］.Oncogene，2002，21(18):2775 －2784