苦碟子对人脐静脉血管内皮细胞株HUVEC 生长的影响*

彭乙华，曾恒礼，蒋 红，蔡 燕，4，陈 敏，陈玉华，康后生，严宗逊

(1.川北医学院附属医院内分泌科，四川 南充 637000;2.富顺县第三人民医院急诊科，四川 自贡 6432013;3.川北医学院附属医院风湿免疫研究所，四川 南充 637000;4.川北医学院附属医院检验科，四川 南充 637000)

糖尿病周围神经病变［1］(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病患者致残的重要原因，严重影响人类健康。故加强对糖尿病周围神经病变的治疗具有重要意义。中医中药治疗糖尿病周围神经病变历史悠久，取得了一定的疗效［2，3］，其中苦碟子注射液凭借其疗效好、毒副作用低尤其受到临床医生的青睐，已广泛用于治疗糖尿病周围神经病变，但其具体机制尚不明确，故本实验以不同浓度的苦碟子注射液处理人脐静脉血管内皮细胞株HUVEC，探讨苦碟子治疗DPN 的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 细胞:人脐静脉血管内皮细胞株HUVEC 由本院风湿免疫研究所保存。

1.1.2 试剂:RPMI1640 培养基(购自美国GIBCO);胎牛血清(购自杭州四季青公司)，使用浓度10%;MTT(购自美国sigma)，用0.1mol/L、pH 值为7.2 的磷酸盐缓冲液配制为5mg/ml 于－20℃保存备用;DMSO 即二甲基亚砜(购自美国sigma);苦碟子注射液由本院药房提供(10ml/支，通化华夏药业有限责任公司生产，国药准字Z20025450))，4℃保存备用，使用时以培养基稀释。

1.1.3 仪器:酶标仪(美国BD-RAD model 680 型)。

1.2 方 法

1.2.1 细胞培养:人脐静脉血管内皮细胞株HUVEC 细胞用RPMI1640 培养基(加有10%的胎牛血清和终浓度皆为100U/ml 的青霉素及链霉素)于37℃、5%CO2条件下培养，待细胞密度为90%左右时用0.25%胰酶消化细胞，按每孔1000 个细胞左右(每孔终体积200μl)传代至96 孔微量反应板中继续培养24 小时后进行后续实验。

1.2.2 药物分组:将苦碟子按终浓度不同分为0μl/ml、 3.125μl/ml、 6.25μl/ml、 12.5μl/ml、25μl/ml、50μl/ml、100μl/ml 共7 组，其中0μl/ml 组为阳性对照组，余6 组为实验组。药物以培养基稀释，每组设6 个复孔，另设不含细胞和药物的空白对照孔和不加细胞仅加药物的对照孔(以排除药物对实验结果的干扰)。

1.2.3 MTT 检测:观察96 孔微量反应板中的细胞，24 小时后细胞基本贴壁，按以上分组情况加药，小心吸取各培养孔中的培养液弃之。将含有不同浓度苦碟子注射液的培养液加至对应组中，继续培养，分别于培养后24 小时、48 小时进行MTT 试验:每孔加入5mg/ml 的MTT 溶液20μl，继续培养4 小时，2000r/m 离心10 分钟后小心吸取上清弃之，每孔加入DMSO 150μl，振荡10 分钟使结晶充分溶解，在酶标仪上于波长490nm 处检测各组吸光度值(OD值)。

1.3 统计分析

2 结 果

培养24 小时和48 小时后检测，各处理组细胞吸光度值明显高于对照组(0μl/m l)细胞的吸光度值，提示苦碟子具有促进细胞增殖的作用，且随药物浓度增加促进作用逐渐增强(见图1)。对同一时间点的各组细胞吸光度值进行单因素方差分析，差异有显著性(p ＜0.05)(见表1)。

表1 不同浓度的苦碟子注射液处理HUVEC 细胞24 小时和48 小时后各组细胞吸光度值比较

3 讨 论

糖尿病(diabetes，DM)是第三位威胁人类健康的重大非传染性疾病，仅次于肿瘤、心脑血管疾病。我国目前约有3 千万糖尿病患者，随着经济发展和生活方式的改变有增加趋势。作为糖尿病最常见的慢性并发症，DPN 的发生率高达60%-90%，主要临床特征为肢体感觉和运动神经功能障碍，表现为肢体麻木、挛急疼痛、肌肉无力、腱反射减弱或消失等。并发难治性溃疡、急慢性骨髓炎乃至败血症、肌肉萎缩和瘫痪、关节畸形等，病情迁延难愈，严重影响糖尿病病人生活质量，是糖尿病患者致残的主要原因，故应加强对糖尿病周围神经病变的治疗。

目前研究发现DPN 的发病与机体代谢紊乱、维生素缺乏和微小血管病变引起的神经缺血、缺氧有关［4］。DPN 患者多存在周围血管的堵塞和血流不畅，并且病变区域还存在侧支血管的建立不足，从而影响病变部位神经、小血管和微血管的血液和营养供应。王海燕等［5］将消渴痛痹颗粒通过灌胃的方式处理DPN 模型大鼠，发现该中药方剂能促进大鼠缺血组织的微血管再生，从而改善局部微循环障碍，减轻或改善了糖尿病周围神经病变。提示促进血管再生、建立病变部位侧支循环，以增加神经和小血管的养供是药物治疗DPN 的机制之一。

苦碟子注射液是从中药苦碟子中提取的富含腺苷、黄酮、异黄酮的复方制剂，具有抗血小板聚集、扩张血管和改善微循环的作用。苦碟子可通过其疏通微循环的作用起到增加冠脉和脑血管血流量，在临床上常用于治疗不稳定性心绞痛［6，7］、心力衰竭［8］、脑梗死［9，10］、糖尿病肾病［11］等，并取得了一定的疗效。研究者在临床工作发现将苦碟子注射液与甲钴胺联用后可明显改善糖尿病周围神经病变患者的症状和体征，说明苦碟子是治疗DPN 的有效药物，但其作用机制尚不明确。本实验结果显示不同浓度的苦碟子注射液作用HUVEC24 小时和48 小时后，MTT 检测其吸光度值明显高于未加药物的对照组(p ＜0.05)，说明苦碟子注射液具有促进HUVEC 增殖的作用。提示苦碟子注射液可能通过促进HUVEC 增殖，从而促进血管增生、侧支循环建立，以改善病变部位血液供应，达到改善DPN 患者的症状和体征的作用。

［1］ 刘顺国，初玲华.糖尿病周围神经病变的研究进展［J］.大理学院学报，2006，5(2):79 －81

［2］ 彭乙华，严宗逊.中医中药治疗糖尿病周围神经病变研究进展［J］.中国医药导报，2011，8(1):11 －12

［3］ Stavniichuk R，Drel VR，Shevalye H，et al.Baicalein alleviates diabetic peripheral neuropathy through inhibition of oxidative-nitrosative stress and p38 MAPK activation［J］.Exp Neurol，2011，230(1):106 －113

［4］ 徐咏平，邓康平，张木勋.糖尿病周围血管病变对周围神经病变的影响［J］.中国康复，2007，22(2):84 －87

［5］ 王海燕，张效科.消渴痛痹颗粒对DM 大鼠周围神经缺血状态新生血管的影响［J］.黑龙江中医药，2011，40(2):43 －44

［6］ 从伟成，陈 琳，刘新红，等.苦碟子注射液治疗不稳定性心绞痛30 例疗效观察［J］.河北中医，2009，31(8):1207 －1209

［7］ 邢同国.苦碟子治疗冠心病心绞痛的疗效观察［J］.中国现代医疗，2010，48(10):45 －46

［8］ 徐茂凤，李永杰，代生厚，等.苦碟子对老年冠心病心力衰竭心功能的改善作用［J］.中国老年学杂志，2010，8(30):2362－2363

［9］ 郑必龙，井 华.盐酸丁喀洛尔联合苦碟子治疗脑梗死疗效观察［J］.中国现代药物应用，2009，3(19):138

［10］ 颜 华，李 琴，蔡 洁.苦碟子治疗脑梗死疗效观察［J］.中国社区医师，2010，12(254):112 －113

［11］ 林海洋，毛小洁，陈恩福，等.苦碟子联合前列地尔治疗早期糖尿病肾病的疗效观察［J］.实用医学杂志，2011，27(4):673－675