胞磷胆碱在家兔体内的药代动力学研究

丁细桃，李军伟，张立康，邱相君

胞磷胆碱为胆碱胞嘧啶核苷二磷酸酯，是细胞膜结构性磷脂生物合成过程中的一种关键物质。吸收后在体内广泛分布，并透过血脑屏障到达中枢神经系统。通过降低脑血管阻力，增加脑血流而促进脑物质代谢，改善脑循环。对于认知障碍、记忆缺失和早期阿尔茨海默病的病人有良好的临床疗效，对促进大脑功能的恢复和促进苏醒有一定作用［1］，是目前治疗卒中最为看好的神经保护剂之一［2］。目前，胞磷胆碱已广泛应用于缺血性卒中、脑外伤和认知障碍的治疗，其在脑出血、帕金森病和青光眼等疾病中的治疗应用也日益受到重视［3］。

国内关于血浆中胞磷胆碱检测和药代动力学的报道较少。本试验首先建立了检测兔血浆胞磷胆碱浓度的高效液相色谱检测方法，并在此基础上研究了胞磷胆碱在家兔体内的药代动力学过程。

1 材料与方法

1.1 仪器 高效液相色谱仪为Agilent1100 系列，包括G1379A 在线脱气机，G1311A 四元泵，G1313A 自动进样器，G1316A 温控箱，G1315B 二极管阵列检测器，和Agilent 化学工作站(Rev A.10.02.［1757］)。电子分析天平(AB204－A，梅特勒－托利多上海仪器公司);涡旋混合器(XK96－B，姜堰市新康医疗器械有限公司);高速冷冻离心机(TGL－16，上海安亭科学仪器厂)。

1.2 试剂和药品 甲醇和乙腈为一级色谱纯，三氟乙酸(Sigma，064K3647)，高氯酸为优级纯，十二烷基硫酸钠(SDS)为分析纯，实验用水为纯净水。胞磷胆碱(140675－200803)、安替比林标准品(100506－200301)均购自中国药品生物制品检定所。胞磷胆碱注射液(091010)，上海福达制药有限公司。

1.3 溶液配制

1.3.1 对照品配制 准确称取胞磷胆碱标准对照品25 mg 于25 mL 容量瓶中，用甲醇溶解定容至25 mL，得浓度为1 g/L 的胞磷胆碱标准储备液;用甲醇稀释成浓度依次为100、10、1 mg/L 的标准工作液(临用时稀释)。

1.3.2 0.1%三氟乙酸(TFA)溶液 准确吸取三氟乙酸1 mL，用纯净水稀释并定容至1 L;0.45 μm 滤膜过滤后使用。

1.3.3 10 mmol·L－1十二烷基磺酸钠(SDS) 准确称取SDS 2.884 g，用纯净水溶解后，于1 000 mL 容量瓶中用纯净水定容，得浓度为10 mmol/L SDS 溶液。0.45 μm 滤膜过滤后使用。

1.4 色谱条件 色谱柱:Agilent TC－C18(4.6 ×150 mm，5.0 μm，USA);保护柱:TC－C18保护柱(4.6 ×12.5mm，5 μm，USA);流动相:乙腈－水－ 10 mmol/L SDS－0. 1%TFA =10:50:20:20(V/V/V/V);流速:0.8 mL/min;柱温:35℃;检测波长:282 nm。

1.5 血浆样品处理方法 准确吸取待测血浆样品0.3 mL 于1.5 mL EP 管中，加入100 mg/L 安替比林内标应用液20 μL，再加入35%高氯酸30 μL，漩涡振荡20 s 后，12 000 r/min 离心10 min。取上清液于自动进样器样品瓶中，设定5 μL 进样检测。

1.6 药代动力学实验 6 只雄性家兔由温州医学院实验动物中心提供，体质量2.0 ～2.5 kg，禁食12 h后用于药代动力学研究。胞磷胆碱注射液用纯净水稀释成浓度为10 mg/mL。每只动物按照10 mg/kg的剂量灌胃给予胞磷胆碱，2 h 后禁食不禁水。分别在给药前和给药后0.33，0.67，1，1.5，2，2.5，3，4，5，6 h 耳缘静脉采血1.0 mL 于肝素化试管中。3 000 r/min 离心10 min 后分离血浆，－80℃保存待检。用上述方法检测血浆胞磷胆碱浓度，用DAS 2.0 程序计算姜黄素的药代动力学参数。

2 结果

2.1 HPLC 图谱 血浆中胞磷胆碱峰形良好，分离完全，无杂质峰干扰。胞磷胆碱保留时间为5. 2 min，内标保留时间为6.5 min 。

2.2 线性关系及定量下限 配成浓度相当于0.25、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00 mg/L 的胞磷胆碱血浆标准品溶液，按“1.5”项方法处理后检测，测定胞磷胆碱峰面积As、内标峰面积Ai，以As/Ai为纵坐标(y)，以所对应各点浓度为横坐标(x)绘制标准曲线。胞磷胆碱的标准曲线回归方程为y =0.2902x－0.0015(r =0.9998)。定量下限为0.25 mg/L(n=6，RSD=6.52%)。

2.3 回收率试验

2.3.1 相对回收率试验 配制低、中、高3 种质量浓度(0.50、10.00、30.00 mg/L)的胞磷胆碱血浆标准品溶液，平行6 组，再按“1.5”项方法处理。依据标准曲线计算各自的浓度，计算相对回收率(结果见表1)。

表1 血浆胞磷胆碱的回收率结果(n=6，±s)

表1 血浆胞磷胆碱的回收率结果(n=6，±s)

加入量(mg/L) 检测量(mg/L) 相对回收率(%) RSD(%) 绝对回收率(%) RSD(%)0.50 0.51 ±0.02 101.47 ±4.53 4.47 80.96 ±1.94 2.39 10.00 10.05 ±0.42 100.52 ±4.19 4.17 81.31 ±1.56 1.92 30.00 30.07 ±0.91 100.22 ±3.02 3.02 82.19 ±0.8 4 1.02

2.3.2 绝对回收率试验 配制低、中、高3 种质量浓度(0.50、10.00、30.00 mg/L)的胞磷胆碱血浆标准品溶液，平行6 组，再按“1.5”项方法处理后测定，计算胞磷胆碱的峰面积，为血浆标准峰面积。另配制浓度为0.50、10.00、30.00 mg/L 的胞磷胆碱纯标准品溶液，直接5 μL 进样检测，记录胞磷胆碱的峰面积，为该浓度的纯对照品的峰面积。计算血浆标准的峰面积与纯标的峰面积的比值，即为绝对回收率(结果见表1)。

2.4 精密度试验 配制低、中、高3 种质量浓度(0.50、10.00、30.00 mg/L)的胞磷胆碱血浆标准品溶液，平行6 组，再按“1.5”项方法处理后于同一日内测定，计算日内精密度;连续3 d 内测定，计算日间精密度(结果见表2)。

表2 血浆胞磷胆碱的精密度结果(n=6，±s)

表2 血浆胞磷胆碱的精密度结果(n=6，±s)

加入量(mg/L)日内(mg/L)RSD(%)日间(mg/L)RSD(%)0.50 0.50 ±0.02 4.03 0.50 ±0.02 4.38 10.00 10.13 ±0.29 2.86 10.17 ±0.34 3.36 30.00 30.19 ±0.84 2.77 30.18 ±0.86 2.85

2.5 样品稳定性

2.5.1 冻融条件下血浆样品的稳定性 配制低、中、高3 种质量浓度的胞磷胆碱血浆标准溶液，每个浓度3 份。经历3 次冰冻－解冻循环后，各取0.3 mL 检测。3 个浓度的RSD 分别为6.49%、5.28%、2.86%，结果显示冻融条件对血浆样品的检测结果没有明显的影响。

2.5.2 冰冻保存血浆样品的稳定性 配制低、中、高3 种质量浓度的胞磷胆碱血浆标准品溶液，每个浓度3 份，在－80℃冰箱冰冻保存4 周后，各取0.3 mL 检测。3 个浓度的RSD 分别为7.03%、3.48%、1.54%，说明血浆样品在冰冻保存的条件下有很好的稳定性。

2.6 血药浓度－时间曲线 6 只家兔按10 mg/kg的剂量灌胃给予胞磷胆碱后，用该HPLC 法测得不同时间胞磷胆碱平均药物浓度－时间曲线见图1。

2.7 药代动力学参数 血浆药物浓度经DAS 2.0程序处理，用房室模型估算药代动力学参数;根据F检验、AIC 值和拟合优度值R2，选择最优房室模型和权重，认为该药在家兔体内符合一室模型，权重1/c2，并计算药代动力学参数。用DAS2.0 计算主要药代动力学参数如下结果见表3。胞磷胆碱在兔体内符合一级消除的一室模型。

图1 单剂量注射10 mg/kg 胞磷胆碱后的平均血浆药－时曲线(n=6)

表3 6 只家兔单剂量注射10 mg/kg胞磷胆碱的主要药代动力学参数

3 讨论

胞磷胆碱的极性很强，易溶于水和甲醇。在反相C18 色谱柱中不易保留，在制剂和血浆检测中，流动相采用水相［4，5］，需要特殊的水相柱。本研究在流动相中加入十二烷基磺酸钠(SDS)使其保留时间延长，在流动相中增加了有机成分，可以减少水相对色谱柱的损伤，普通色谱柱就能很好地出峰。采用高氯酸直接沉淀蛋白的方法对血浆进行前处理，处理方法简单、专属性高、分离完全、成本较低廉;检测时间短，7.0 min 能完成一个样品的检测，特别适合大批量样品的自动化检测工作;方法回收率高，日内、日间精密度RSD 均小于10%，符合药代动力学研究的要求。适于化学药物分析和临床药物代谢动力学的研究，结果可靠。

胞磷胆碱是一种生物利用度超过90%的水溶性化合物。外源性胞磷胆碱进入体内后，很快分解为胆碱和胞苷，它们穿过血脑屏障，并在中枢神经系统内重新合成胞磷胆碱［6］。在健康志愿者中，胆碱和胞苷水平在注射后30 min 达峰值，并且其循环浓度在此后6 h 持续增高。口服胞磷胆碱能被迅速而完全地吸收，在肠壁内被水解为胆碱和胞苷，它们进入各种利用胞磷胆碱作为介质的生物合成通路，与静脉注射胞磷胆碱具有相同的生物利用度和相似的药代动力学特征［6］。放射性示踪剂研究表明，胞磷胆碱主要通过呼出CO2和尿液排泄，CO2和尿液消除的半衰期分别为51 h 和71 h［7］。大鼠口服给予胞磷胆碱后，血浆中胆碱和胞苷水平持续升高4 ～6 h。持续给予42 ～90 d 后，脑细胞膜3 个主要的磷脂—磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸升高［1］。

本研究先建立高效液相色谱法检测兔血浆胞磷胆碱浓度，研究了胞磷胆碱在家兔体内的药代动力学过程。结果显示:6 只雄性家兔单剂量口服给药胞磷胆碱后，胞磷胆碱在1.08 h 到达18.79 mg/L 的峰值浓度，血浆消除半衰期为1.03 h;在兔体内符合一级消除的一室模型，与静脉给药的药代动力学参数基本一致［5］

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［2］Secades JJ，Lorenzo JL. Citicoline:pharmacological and clinical review，2006 Update［J］. Methods Find Exp Clin Pharmacol，2006，27(Suppl. B):1－56.

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［4］程林，赵山山，任新彩，等. HPLC 法测定胞磷胆碱钠颗粒中胞磷胆碱钠的含量［J］. 河北化工，2007，30(6):74.

［5］刘涛，王鹏程，周海涛，等. 反相高效液相色谱法检测兔血浆胞磷胆碱浓度［J］. 中国药师，2011，14(4):488－490.

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