CEA-rv 诱导特异性CIK 细胞对Lovo 细胞株杀伤作用的研究

王新帅，秦 玲，冯笑山，高社干，祁岩超

大量研究显示肿瘤患者免疫功能低下，肿瘤细胞通过多种机制逃逸机体免疫系统的识别［1］。树突状细胞(DCs)是体内最强的抗原提呈细胞，是机体免疫应答的始动者。通过外源的肿瘤抗原负荷DCs增强其免疫性及抗原递呈作用，以DC 为基础的肿瘤免疫治疗已成为当今肿瘤治疗的研究热点。本研究采用负荷CEA-rV 负荷脐血来源的DC 后，再与细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced kill cell，CIK)混合培养，观察CEA－rV－DC－CIK 对结肠癌细胞株Lovo 的杀伤活性，从而为CEA 阳性表达肿瘤细胞免疫治疗提供实验依据和理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料 IL-2、IFN-γ、GM-CSF(grannulocyte monocyte-colony stimulating factor)、TNF-α 及CD3 单抗购自美国Cytolab 公司;PGE2(Prostaglandin E2)购自美国Cayman 公司;鼠抗人CD40、CD80、CD83、CD86 荧光抗体购自美国eBioscience 公司;RPMI 1640 购自美国Gibco 公司;MTT 购自美国Sigma 公司;新生小牛血清购自杭州四季青生物公司;淋巴细胞分离液购自中国医学科学院血液病研究所;蛋白提取试剂盒购自中国康成生物公司;人结肠癌细胞株Lovo 由广州医学院肿瘤研究所提供;酶标仪为美国Thermo Labsystem 生产的MK3 型。

1.2 实验方法

1.2.1 CEA-rV 的制备及滴度测定 CEA-rV 的制备及滴度测定依照参考文献［2］中方法进行，进行滴度测定后置4℃冰箱保存备用。

1.2.2 脐血的采集和分离 脐血样本来自广州市荔湾医院，共10 份。其孕母HBV、HCV、HIV 和梅毒检测阴性。用淋巴细胞分离液经密度梯度离心法分离脐血单个核细胞(cord blood mononuclear cells，CBMC)。

1.2.3 DC 和CIK 的诱导 ①DC 的诱导:取分离的CBMC 置入6 孔培养板，2 h 后吸出悬浮细胞，贴壁细胞中加入20 ng/mL IL-4 和100 ng/mL GM-CSF，隔天换液，诱导培养前期加入CEA-rV，后期加入20 ng/mL TNF-α 和1 μg/mL PGE2。②CIK 的诱导:悬浮细胞中加入1 000 μg/mL IFN-γ、500 ng/mL CD3单抗、200 μg/mL IL-2，每2 ～3 d 传代培养1 次，传代时补加细胞因子。

1.2.4 DC 的形态和免疫学鉴定 应用倒置显微镜、透射电镜、扫描电镜鉴定成熟DC 的形态。采用流式细胞仪(美国BD 公司)的Cellquest 软件分析成熟DC 的免疫学CD 分子表型，加鼠抗人CD40、CD80、CD83、CD86 荧光抗体及其对照品，4℃避光标记30 min 后上机检测。

1.2.5 实验分组 实验共分4 组:①CBMC 组:未经诱导的CBMC;②CIK 组:未经肿瘤抗原刺激的CIK;③DC-CIK 组:DC 与CIK 混合培养;④CEA-rV-DCCIK 组:负载CEA-rV 的DC 和CIK 按1∶10 的比例混合培养。

1.2.6 各组细胞杀伤活性的测定 将各组效应细胞与Lovo 细胞按10∶1 的比例放入96 孔板，另设单独Lovo 细胞组和单独效应细胞组，每组设3 个复孔。置37℃、5%CO2培养箱中孵育4 h，应用MTT 法［3］在酶标仪上测定各组细胞在570 nm 处吸光度(A)值，取3 个复孔的均值作为测定结果，杀伤活性的计算公式:杀伤活性(%)=［(靶细胞OD 值+效应细胞OD 值－实验组OD 值)/靶细胞OD 值］×100%。

2 结果

2.1 DC 的形态学鉴定结果 在培养前3 d 大部分DC 细胞贴壁生长，细胞形态出现不规则改变，少量细胞悬浮并可见少量突起。加入TNF-α 和PGE2后，大量细胞悬浮，突起明显增多。培养10 d 的成熟DC 表面有大量突起和明显的伪足，表面凸凹不平(图1A)。透射电镜显示细胞形态不规则，胞浆丰富，见多个线粒体和电子密度高低不均的大量溶酶体，粗面内质网增生活跃及大量的吞噬小体(图1B)。扫描电镜可见DC 的胞体呈多角形、椭圆形、圆形，表面有大量的片状突起和长的突起，其突起又有细小的分枝，分枝末端又可分成细小的丝状伪足(图1C)。

图1 成熟DC 的形态学鉴定结果

2.2 DC 的免疫分子表型结果 成熟DC 表达主要组织相容性抗原Ⅰ、Ⅱ类分子CD86、CD80、CD83 和CD40，其中高表达CD86 和CD40，中度表达CD83 和CD80，表达率分别为(82. 66 ±6. 22)%、(69. 40 ±6.82)%、(57.49 ±6.59)%和(51.14 ±6.31)%，流式细胞仪Cellquest 软件对DC 免疫分子表型的分析结果见图2。

图2 流式细胞仪对DC 免疫分子表型的分析结果

2.3 各组细胞对Lovo 细胞株的杀伤结果 CBMC组、CIK 组、DC-CIK 组、Ag-DC-CIK 组对靶细胞Lovo的杀伤活性分别为29. 31%、42.12%、44. 81% 和58.98%;单因素方差分析结果显示差异有统计学意义(F=25.169，P =0.001);其中CEA-rv-DC-CIK 组对Lovo 的杀伤活性比另外3 组高，差异均有统计学意义(P ＜0.05)。具体结果见表1。

表1 各组细胞对Lovo 细胞株的杀伤结果(±s，%)

表1 各组细胞对Lovo 细胞株的杀伤结果(±s，%)

①任两组比较P ＜0.05

分 组 n 杀伤活性CBMC 组 10 29.31 ±5.63①CIK 组 10 42.12 ±3.92①DC-CIK 组 10 44.81 ±4.24①CEA-rV-DC-CIK 组 10 58.98 ±7.36①F 值 25.169 P 值0.001

3 讨论

肿瘤病人免疫功能低下，在肿瘤微环境影响下DC 功能受抑，肿瘤病人的树突状细胞(DCs)存在免疫功能缺陷，不能引发有效的抗肿瘤免疫反应［4，5］。MHC 限制性又严重影响异体DCs 输注治疗肿瘤的临床应用。脐血细胞免疫原性弱，含大量造血干细胞。如果从脐血中培养肿瘤抗原特异性的DCs，用于治疗肿瘤，将会大大促进DCs 免疫治疗肿瘤的临床应用［6］。CEA-rV 是用天坛株761 痘苗病毒为截体，以CEA 抗原DNA 为目的基因构建的既有CEA抗原的高表达，又可刺激机体产生CEA 抗体的重组基因痘苗病毒，动物实验表明，单用CEA-rV 皮下注射，对CEA 阳性的肿瘤有明显的预防和治疗作用［7］。

本研究中将CBMC 诱导分化为DC，并对成熟DC 进行了形态学鉴定。当DC 在加入TNF-α 和PGE2 后，大量细胞悬浮，突起明显增多，细胞表面有大量突起和明显的伪足，表面凸凹不平。透射电镜可见胞浆丰富，多个线粒体和大量溶酶体，粗面内质网增生活跃及大量的吞噬小体。扫描电镜可见细胞表面有大量的片状突起和长的突起，其突起又有细小的分枝，分枝末端又可分成细小的丝状伪足。免疫学鉴定显示成熟DC 高度表达CD86 和CD40，中度表达CD83 和CD80，CD86 是DC 成熟的重要标志，表达率为82. 66%。本研究结果显示CEA-rVDC-CIK 组比其余各组的杀伤活性高，差异均有显著统计学意义(P ＜0.05)。说明经CEA-rV 抗原负载的DC 与CIK 混合培养后，成熟的DC 以MHC 限制的方式处理CEA 抗原，并将该信号呈递给CIK，从而增强了特异性CIK 对CEA 阳性表达肿瘤Lovo 细胞株的特异识别和杀伤能力。

综上所述，经CEA-rV 负荷CBMC 诱导生成的DC，能进一步激活CIK，对Lovo 细胞株产生高效而特异的杀伤作用，其杀伤活性明显高于CIK 和DC-CIK，为CEA 阳性表达肿瘤的细胞免疫治疗提供了实验数据和理论依据。此外脐血是一个较好的CIK 的来源，又因脐血来源丰富，质量标准易于控制，这也为CIK免疫治疗技术的常规临床应用提供了方便。

［1］De Vleeschouwer S，Fieuws S，Rutkowski S，et al.Postoperative adjuvant dendritic cell-based immunotherapy in patients with relapsed glioblastoma multiform［J］.Clin Cancer Res. 2008;14(10):3098－3104.

［2］杨洁，罗超权，卢方安.人癌胚抗原重组痘苗病毒的构建和制备［J］.中国生物化学与分子生物学，1999，15(1):54－58.

［3］张志强，田志刚，崔正言，等. MTT 法检测NK 和LAK 活性的方法学探讨［J］. 中国实验临床免疫学杂志，1994，6(1):12.

［4］Joshi PS，Liu JQ，Wang Y，et al. Cytokine-induced killer T cells kill immature dendritic cells by TCR-independent and perforin-dependent mechanisms［J］. J Leukoc Biol，2006，80(6):1345－1353.

［5］Introna M，Franceschetti M，Ciocca A，et al. A rapid and massive expansion of cord blood-derived cytokine-induced killer cells:an innovative proposal for the treatment of leukemia relapse after cord blood transplantation［J］.Bone Marrow Transplant，2006，38(9):621－627.

［6］Weng DS，Zhou J，Zhou QM，et al.Minimally invasive treatment combined with cytokine-induced killer cells therapy lower the short-term recurrence rates of hepatocellular carcinomas［J］. J Immunother，2008，31(1):63－71.

［7］Qi YC，Wang XS，Yang B，et al. Preventive and therapeutic effects of CEA recombinant vaccinia virus on CEA positive tumor［J］.J Tumor Marker Oncol，2004，19:409－413.