低分子肝素对膜性肾病大鼠转化生长因子-β 1、骨形态发生蛋白-7表达的影响

刘中柱,马 可,刘艳姝,王 振,张 浩

(1.佳木斯大学附属第一医院肾内科,黑龙江佳木斯 154003;2.一汽总医院肾内科,吉林 长春 130013)

膜性肾病(MN)为免疫复合物形成和沉积于肾小球基底膜 (GBM)所致,由于 MN常合并高凝状态,肾小球内纤维蛋白沉积和微血栓形成,进一步加重 MN的 GBM改变,使尿蛋白增加,严重影响 MN的治疗效果及预后[1]。转化生长因子-β1(TGF-β1)的表达可作为反映 MN肾活检组织肾小球硬化及肾间质纤维化的一个标志[2]。骨形态发生蛋白-7(BM P-7)在病理条件下亦参与了肾脏形态和功能的保护[3]。近年来不少实验研究表明,BM P-7在各种急慢性肾病、血管钙化的干预治疗中均可发挥重要保护作用[4]。近年来人们对低分子肝素(LMW H)的药理作用认识不断深入,发现使用 LMW H治疗 NS可减少尿蛋白,升高血浆蛋白,降低肾脏的纤维化。本实验主要通过研究 LMWH对 MN大鼠尿蛋白的减少所发挥的作用,并探讨 LMW H对大鼠肾组织中TGF-β1、BM P-7表达的影响及其可能的发生机制,从而对 MN的治疗起到指导作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物模型的建立与分组

随机将 40只大鼠随机分为 4组,分别为空白对照组 (A组 )、模型组 (B组)、LMWH注射组 (C组)、厄贝沙坦喂养组(D组 ),每组 10只大鼠。各组大鼠均适应性喂养 1周,并定性检测尿蛋白均为阴性。按文献方法造模[7],B组、C组、D组大鼠均给与 C-BSA1mg溶于 0.5mL PBS中 ,与等量不完全弗氏佐剂充分混合乳化,在大鼠双侧腋下、腹股沟处作多点皮下注射进行预免疫。预免疫一周后,各组大鼠均由静脉注射 C-BSA2.5mg,每周 3次 ,共注射 3周 ,制备 MN大鼠模型。于造模开始后第 2周即开始测定各组大鼠 24h尿蛋白,以后每隔一周采集尿液一次,分别记录。LMW H注射组大鼠给予 LMW H300IU/100g◦ d,溶于 0.9%1mL生理盐水中给大鼠进行皮下注射;厄贝沙坦喂养组大鼠给予厄贝沙坦50mg/kg每日清晨灌胃;空白对照组、模型组大鼠给与20mL/kg生理盐水注射。以上药物干预于第 3周末开始,共计 3周。于造模成功后第 6周末水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(共 24只,每组 6只 ),处死大鼠 ,取肾脏。

1.2 标本的收集与处理

1.2.1 小时尿蛋白定量测定

于造模开始后第 2周即开始由代谢笼收集各组大鼠 24h尿液,由生化测定仪测定各组大鼠 24h尿蛋白,以后每隔一周采集尿液一次,分别记录。

1.2.2 病理学检查

于造模成功后第 6周末 10%水合氯醛 0.35g/kg腹腔注射麻醉大鼠,迅速开腹,后以生理盐水经肾动脉灌洗肾脏后取肾脏。固定部分肾脏组织进行 Masson染色。

1.2.3 Masson染色

石蜡切片,蒸镏水洗 2次,铁明矾 50℃下 20min,蒸镏水洗 5次后苏木素染色 5min,95%的乙酸洗 5次,饱和苦味酸溶液分化,自来水洗 10次。Ponceaus染色剂染色 2次,再 1%磷钼酸分化 10次,1%醋酸洗 5次,阿尼林兰对比染色,1%醋酸洗 5次,95%乙醇脱水,乙酸洗 3次,最后二甲苯透明,封片。

1.2.4 RT-PCR检测

保存的肾脏组织固定于-70℃冰箱中 ,进行 RT-PCR测定。步骤如下:

从已知 Gen-Bank序列设计鼠 TGF-β1和 GAPDH引物。引物序列如下:TGF-β 1:上游引物 5'CAG TGG CTG AAC CAA GGA GAC3';下游引物 5'CGA CCC ACG T AG TAG ACG ATG 3';扩增产物为 500bp。 GAPDH:上游 5'CCA CAG TCC ATG CCA TCA CT 3';下游 5'GCC TGC TTC ACC ACC T TC TTG3';扩增片段为 268bp,TM值为61.8。

1.2.4.1 总 RN A提取:采用大连宝生物有限公司 Biozol试剂盒,严格按说明书操作。

1.2.4.2 反转录反应:在 Microtube管中配制下列混合液:dNTP Mixture 1μL,Oligo dT Primer1μL,Template RN A4 μL,5× Prime Script Buffer4μL,RNase Inhibitor 0.5μL.Prime Script RTase0.5 μL,RNase Free dH2O 9 μL,共计 20 μL。在 PCR仪上按下列条件进行反转录反应:42℃15～ 30min,95℃5 min。

1.2.4.3 PCR反应:按下列组成配制 PCR反应液:10×PCR Buffer5μL,dNTP Mixture2μL,上游引物 0.5μL,下游引物 0.5 μL,TaKaRa Ex Taq酶 0.5 μL,反转录反应液 5 μL,再加入 RNase Free dH2O使反应液达到 50 μL。在 PCR仪上按下列条件进行 PCR反应:94℃ 预变性 2min,94℃变性30s,55～ 65℃退火 30s,72℃引物延伸 lmin,循环 30次后72℃延伸 5min。

1.2.4.4 PCR产物电泳:1.5% 琼脂糖凝胶制成厚度约为0.8cm琼脂糖凝胶板,放入电泳槽。仔细将 5 μL PCR产物样本与上样缓冲液加入加样槽 ,接通电源,电压条件为 5V/cm。电泳 1h后紫外灯下观察荧光带 ,以 DN A marker为标准 ,并应用自动电泳凝胶分析系统对每一样品 PCR产物扩增的特异性片段进行光密度扫描,并以特异扩增片段与 GAPDH条带灰度值比值来表示其相对含量,分析电泳结果。

1.3 统计学处理

统计学分析运用 SPSS16.0软件,所有指标均用平均数±标准差± s)表示,组间两两比较采用 q检验,以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠尿蛋白的变化

治疗 3周后 LMW H注射组、模型组、厄贝沙坦喂养组大鼠尿蛋白排泄量增多,较空白对照组大鼠尿蛋白排泄量有显著差异 (P＜0.05),LMW H注射组与模型组大鼠尿蛋白排泄量相比显著减少 (P＜0.05);LMW H注射组与厄贝沙坦喂养组大鼠相比,尿蛋白的排泄量没有明显差异(P＜0.05)。各组大鼠 24h尿蛋白排泄量的变化见 表1,图 1。

表1 各组大鼠 24h尿蛋白排泄量的比较(±s,mg/24h)

表1 各组大鼠 24h尿蛋白排泄量的比较(±s,mg/24h)

注:*与正常对照组相比,P＜0.05;#与模型组相比,P＜0.05。

尿蛋白 A组 B组 C组 D组2周 3.012± 0.14613.029± 0.223* 10.665± 0.524*# 10.807± 0.207#*4周 5.362± 0.21619.529± 0.696* 18.165± 0.604*# 18.473± 0.431#*6周 6.511± 0.35923.862± 1.291* 21.331± 1.183*# 22.140± 1.661#*

2.2 LMW H对 MN大鼠肾脏 BMP-7免疫组织化学染色的影响

空白对照组大鼠肾脏间质出现阳性表达。 LMWH注射组、模型组、厄贝沙坦喂养组大鼠肾脏间质 BM P-7的表达较空白对照组 BM P-7的表达相比显著减少 (P＜0.05);LMWH注射组与模型组大鼠肾脏间质 BMP-7的表达相比增多,差异有统计学意义 (P＜0.05);LMWH注射组与厄贝沙坦喂养组大鼠相比,没有明显差异 (P＞ 0.05)。见表2。

表2 各组大鼠肾脏 BM P-7免疫组化结果(±s,n=6)

表2 各组大鼠肾脏 BM P-7免疫组化结果(±s,n=6)

*与正常对照组相比,P＜0.05;#与模型组相比,P＜0.05。

组别 BM P-7 A组 0.377± 0.047 B组 0.122± 0.054*C组 0.267± 0.378*#D组 0.250± 0.045*#

2.3 低分子肝素对 MN大鼠肾脏组织 TGF-β 1mRN A表达的影响

治疗 3周后低分子肝素注射组、模型组、厄贝沙坦喂养组大鼠肾脏组织 TGF-β1mRN A的表达与空白对照组TGF-β 1mRN A的表达相比明显增多 (P＜0.05);低分子肝素注射组与模型组大鼠肾脏组织 TGF-β1mRNA的表达相比减少,差异有统计学意义 (P＜0.05);低分子肝素注射组与厄贝沙坦喂养组相比 ,没有明显差异 (P＞ 0.05)。说明低分子肝素注射治疗 MN大鼠 3周后,可显著降低肾组织中TGF-β1mRN A的表达。见表3。

表3 各组大鼠肾脏 TGF_β1mRN A表达的结果 ±s)

表3 各组大鼠肾脏 TGF_β1mRN A表达的结果 ±s)

注:*与正常对照组相比,P＜0.05;#与模型组相比,P＜0.05。

A组 B组 C组 D组T GF- β1mRN A 0.575±0.1091.268± 0.289* 0.819± 0.157*# 0.796±0.153*#

3 讨论

本实验采用 C-BSA方法建立大鼠 MN病模型,应用免疫组化方法观察 BMP-7在肾组织中的表达情况。结果发现在大鼠正常肾组织中有着丰富的 BM P-7表达,在肾间质可见阳性染色,主要分布在肾小管和集合管。而模型组大鼠肾组织中 BMP-7表达显著下降 (P＜0.05),提示 BM P-7可能在维持正常肾结构和功能方面发挥重要作用,而病变肾组织则会减少其表达。如前述,TGF-β 1的表达与之相反,在正常肾组织中表达甚少,而在病变肾组织中,其表达明显增多 (P＜0.05)。上述结果表明 BM P-7确可制约 TGF-β 1的致纤维化作用,而 BM P-7蛋白表达下降很可能是 TGF-β 1mRNA表达上调促进纤维化形成的原因之一,但是其中具体作用机制尚不清楚,还有待于进一步研究。LMWH不仅具有抗凝、降尿蛋白及抗炎作用,更重要的是 LMW H还可抑制肾小球系膜细胞、上皮细胞、内皮细胞、肾小管上皮细胞及浸润的单核细胞释放出各种因子刺激系膜细胞增殖和基质增生[5]。大量的研究显示应用 AngⅡ受体拮抗剂类(ARB)药物除可特异性阻断 AngⅡ而发挥降低蛋白尿和肾脏保护作用,还可间接减少 ECM积聚,,使肾脏的 TGF-β 1的基因表达接近正常,可有效的抑制肾脏组织细胞炎症反应和肾脏纤维化及肾功能损害,发挥肾脏保护的作用。因此,本实验以ARB治疗 MN作为对比,以观察 LMW H在 MN治疗中的作用。本实验结果提示,模型组大鼠 24h尿蛋白含量增多(P ＜0.05),而 LMWH治疗后 ,大鼠 24h尿蛋白会明显减少,说明 LMW H可有效减轻蛋白尿症状,可在一定程度上保护大鼠的肾脏功能。LMW H治疗组大鼠肾组织中 TGF-β 1mRNA的表达明显低于模型组大鼠肾组织中 TGF-β 1mRNA的表达,而肾间质 BM P-7的表达增加,提示LMWH可能通过增加 BM P-7的表达,抑制 TGF-β 1的致纤维化作用,降低肾小球的硬化及肾间质的纤维化,从而促进 MN早期缓解。虽然 LMW H注射组与厄贝沙坦喂养组相比,没有统计学意义,但 LMW H治疗 MN与厄贝沙坦比较,其用药方便,皮下注射吸收率高,为一种安全有效的治疗方法。

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