多浪羊IFN－γ基因克隆及核苷酸序列分析

左文斌 潘 辉 李莲瑞

干扰素(IFN－γ)是具有正常生理功能的细胞在适宜的诱生剂的作用下产生的能够抑制病毒增殖的一类重要细胞因子，其化学本质是一种糖蛋白，具有广谱抗病毒、抗细胞分裂增殖及免疫调节等多种生物学功能［1］。干扰素具有抑制细胞增生、免疫调节及抗炎症活性，因而对宿主防御机制很重要。

随着病原菌新毒株、变异株的不断出现，我国动物疾病的防治面临严峻的挑战。自发现干扰素以来，干扰素已经显示出极强的抗病毒、抗肿瘤以及免疫调节活性和应用前景，干扰素的研究越来越受到人们的广泛关注［2］。目前干扰素在基础理论和实践应用上仍需要进行大量的研究，通过对多浪羊IFN－γ基因的克隆与序列分析，能够为多浪羊IFN－γ的功能研究和免疫应答相关基因的筛选奠定基础，为IFN－γ基因工程药物的生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

多浪羊由塔里木大学动物科学学院提供;DH5α感受态细胞本实验室制作保存;Trizol Reagent购自Invitrogen公司;RT－PCR试剂盒、pMD18－T载体、DL2000 DNA Marker、限制性内切酶EcoR I和Xho I购自大连宝生物工程有限公司;DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自杭州爱思进生物技术有限公司;其它试剂由本实验室配制。

1.2 方法

1.2.1 总 RNA 提取

无菌采集多浪羊羊外周血20 mL，加入3.8%枸橼酸钠抗凝。然后参照贺艳艳［3］等分离淋巴细胞的方法，分离淋巴细胞。按Invitrogen Trizol试剂说明书提取总RNA，置于－70℃保存备用。

1.2.2 引物设计

根据 GenBank上的 IFN－γ基因序列 NM_001009803设计引物:

上游引物为 5’－GGCCTCGAGAGGCAGGAGAACCATTAC －3’，

下游引物为5’－GGCGAATTCCACAGGAGCTACCGATTT －3’。

1.2.3 两步法扩增IFN－γ基因

采用使用Invitrogen公司的SuperScript cDNA First－strand Synthesis System进行逆转录。反应产物保存于－20℃备用。

PCR反应体系:10×one step RT－PCR buffer 2 μL，dNTP1.6 μL，Taq DNA 聚合酶 0.4 μL，PF(20 pmol/ μL)0.5 μL，PR(20 pmol/ μL)0.5 μL，模板 cDNA 0.5 μL，ddH2O 14.5 uL

PCR反应条件:95℃ 5 min;然后94℃ 1 min，55℃ 30 s，72℃ 40 s 35个循环;72℃ 10 min，4℃保存。

1.2.4 琼脂糖凝胶电泳鉴定RT－PCR结果

采用1.0%的琼脂糖凝胶电泳，检测RT－PCR结果。

1.2.5 IFN －γ 基因的克隆及鉴定

用切胶回收试剂盒回收目的基因后与pMD18－T载体连接，转化DH5α感受态细胞，涂布含有氨苄青霉素的平板，37℃过夜培养。挑取单菌落在LB液体培养液中培养，进行菌液PCR和酶切鉴定。

1.2.6 IFN－γ基因测序及序列分析

挑选阳性克隆送北京华大中生科技发展有限公司进行测序，测序结果采用DNAman等软件进行序列分析。

2 结果

2.1 IFN－γ基因RT－PCR结果

RT－PCR扩增后，产物经过1%琼脂糖凝胶电泳，与DNA Marker DL 2000比较，目的条带出582 bp与预期相吻合(见图1)。

图1 IFN－γ－PCR结果

2.2 IFN－γ－pMD－18T重组质粒结果鉴定

挑取LB琼脂平板上的白色菌落，通过菌液PCR鉴定，菌液PCR结果见图2，然后对鉴定为阳性的菌液提取质粒DNA，用EcoR I和Xho I进行双

图2 IFN－γ－pMD－18T重组质粒菌液PCR结果

2.3 IFN－γ基因序列分析

(1)测序后的多浪羊IFN－γ基因的核苷酸序列

图3 IFN－γ－pMD－18T重组质粒双酶切结果

测序结果全长为582bp(见图4)，将测得的核酶切鉴定(图3)，图3结果出现两条明显条带:2692 bp处为pMD－18T质粒、574 bp处为酶切后的目的基因。苷酸序列用Expasy tools分析，将核酸序列和氨基酸序列相对应(见图4)。由图5可以看出多浪羊IFN－γ的完整开放阅读框的核苷酸序列长度为501bp，成熟蛋白编码的氨基酸序列长度为166个氨基酸。

图4 多浪羊IFN－γ基因全序列

(2)IFN－γ核苷酸多序列比对结果

通过比对发现扩增的目的片段在第391位一个相对保守的碱基处出现了一个突变，由A突变成了G，而在此位置上参比的序列都是A，可能A是高度保守的(图5)。

图5 IFN－γ核苷酸多序列比对

(3)IFN－γ氨基酸多序列比对结果

根据氨基酸多序列比对发现第131位由一个赖氨酸(AAA)变成了一个谷氨酸(GAA)(见图6)。

图6 IFN－γ氨基酸多序列比对

3 讨论

随着人们对干扰素研究的不断深入，尤其是在分子生物学方面的研究，干扰素的分子结构、理化特性、生物学特性 、产生和作用 机理不断得到阐明。在未来的临床研究中，IFN将会推进我们对免疫调节过敏，哮喘，自身免疫性疾病，肿瘤的发展，器官移植，慢性感染机制的了解，可能会发现有效和有针对性的治疗疾病的方法［4］。鉴于IFN－γ强大的生物学功能，其相关基础和应用研究日渐增多，一些干扰素制品也逐渐出现和进入临床应用［5］。由于体外细胞刺激时干扰素的表达量很低且难以纯化，难以获得足够量的蛋白用于试验研究和临床应用，因而采用基因工程手段制备干扰素显得尤为重要。

近年来，随着对细胞因子研究的不断深入和分子生物学技术的发展，在国内多种动物的IFN－γ基因［6－9］相继被克隆，其相应的生物制剂在临床上也得到了显著的效果。

本研究应用RT－PCR技术成功克隆的多浪羊IFN－γ基因片段大小在582 bp左右。将测序结果进行分析得出多浪羊IFN－γ的核苷酸序列长度和氨基酸序列长度，通过NCBI BLASTp进行分析对多物种IFN－γ核苷酸和氨基酸多序列比对发现本实验测得目的基因的核苷酸在391位发生了突变，导致氨基酸序列的第131位氨基酸由赖氨酸突变为谷氨酸。赖氨酸为碱性氨基酸而谷氨酸为酸性氨基酸，编码的多肽链第131位的氨基酸由碱性氨基酸突变为酸性氨基酸，其氨基酸的性质变化较大，这可能是多浪羊适应新疆当地环境的一种选择性突变，需要进行更进一步的研究是非常有必要的，对于研究动物的分子进化及其在动物分类上应用可能具有一定的意义。

［1］ 王春霞，王林川，黄爱芳，等.番鸭IFN－α基因的克隆与序列分析［J］.华南农业大学学报，2002，23(4):68－70.

［2］ 张永红，朱丽，鄂晓丹.动物γ干扰素基因研究进展［J］.内肛科技，2009，8:28－29.

［3］ 贺艳艳，潘辉 ，刘书东等.新疆多浪羊淋巴细胞分离和培养［J］.塔里木大学学报，2010，22(4):11 －14.

［4］ Akdis M，Burgler S.Interleukins，from 1 to 37，and interferon － γ:receptors，functions，and roles in diseases［J］.The Journal of allergy and clinical immunology，2011，127(3):701 －721.

［5］ 田园，丁壮，岳玉环.干扰素γ生物学功能及其应用的研究进展［J］.中国生物制品学杂志，2010，23(10):1147－1150.

［6］ 王春霞，王林川，黄爱芳，等.番鸭IFN－α基因的克隆与序列分析［J］.华南农业大学学报，2002，23(4):68－70.

［7］ 海岗，韩宗玺，邵昱昊，等.共表达口蹄疫病毒vpl基因和山羊IFN－γ基因的重组山羊痘病毒的构建［J］.中国预防兽医学报，2008，30(5):334－337.

［8］ 王黎霞，王彩霞，徐赓，等.鸡干扰素－γ的原核表达与生物活性［J］.中国兽医杂志，2010，46(3):28－30.

［9］ 齐冰，何新，李文雍，等.干扰素α应答基因的克隆及在兔早期胚胎发育中功能分析［J］.生物化学与生物物理进展［J］，2006，33(1):1094－1098.