阿托伐他汀对CLP大鼠模型的保护作用

曲茂兴，于 健*，李春树，吕慧怡

脓毒症(Sepsis)是由感染引起的全身炎症反应，发病率有逐年上升趋势，是ICU患者死亡的主要原因之一［1］。阿托伐他汀是临床常用的调脂药，大规模临床试验证明，它可显著降低心血管疾病的致残率和死亡率［2－5］，同时具有抗炎［6－11］、改善内皮细胞功能和NO活性等作用［12－14］。本实验采用盲肠结扎穿孔术(CLP)建立脓毒症大鼠模型，观察阿托伐他汀对大鼠血浆一氧化氮(NO)和肝组织匀浆丙二醛(MDA)的影响，探讨阿托伐他汀的临床应用价值。

1 材料和方法

1.1 仪器设备 DS－88型电子秤(武汉自动化仪表厂)，TG16WS高速台式离心机(长沙科学仪器厂)，UV－2100 Spectrophotometer紫外/可见分光光度计(日本岛津公司)，XW－80A旋涡混合器(上海青浦沪西仪器厂)，HH－W21－600电热恒温水浴箱(上海医用恒温设备厂)。

1.2 试剂和材料 阿托伐他汀(辉瑞制药有限公司生产，批号:081128);一氧化氮(NO)，微量丙二醛(MDA)试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.3 动物分组及给药 75只健康雄性SD(Sprague－Dawley)大鼠，体质量184～202 g，购于大连医科大学实验动物中心。按照随机排列表法分为3组，每组25只。对照组用食用淀粉40 mg/kg加入2mL生理盐水，制成混悬液，连续灌胃5 d，第6日行假手术。脓毒症组同样用食用淀粉灌胃，第6日行CLP，用丝线结扎盲肠总长度的30%［15］，在盲肠游离端选2个相距3mm点分别刺穿盲肠，术后置笼内活动，不禁饮食。阿托伐他汀组，用阿托伐他汀40 mg/kg［16］溶于2mL生理盐水，制成混悬液，连续灌胃5 d，第6日行CLP。

1.4 标本收集及检测 分别在术后0、2、6、10、24 h时间点眼眶采血，肝素抗凝管静置30min，4℃、3000 r/min离心15min，取血浆于－20℃冰箱中保存。剪取肝脏组织在冰冷的生理盐水中漂洗，滤干，称湿重约0.1 g倒入玻璃匀浆管中，加入1mL 0.86%冷生理盐水研磨，使组织匀浆化，4℃、2000 r/min离心15min，取上清于－20℃冰箱中保存。用分光光度计检测血浆NO、肝脏组织匀浆MDA的含量。24 h时间点取心脏、肺、肝脏、空肠标本，置10%甲醛溶液中固定，依次常规脱水，石蜡包埋，制成切片，苏木精－伊红(HE)染色，光镜下检查组织病理学改变。

1.5 统计学方法 采用SPSS 11.5统计软件，计量资料以表示，正态分布变量多组间比较用方差分析，3个处理组均数的两两比较用LSD－t检验法，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血浆NO的比较 2 h时对照组与脓毒症组(P=0.029)和阿托伐他汀组(P=0.038)比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。脓毒症组在术后6 h明显升高，24 h达到峰值(329.04±21.15)μmol/L;阿托伐他汀组在术后10 h明显升高，在24 h达到峰值(209.53±10.68)μmol/L。在0 h和2 h时间点，阿托伐他汀组与脓毒症组比较，差异无统计学意义(P ＞0.05)，在 6 h、10 h、24 h时间点，阿托伐他汀组与脓毒症组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)，见图1。

图1 各组血浆NO浓度的比较

2.2 各组肝组织匀浆MDA的比较 脓毒症组和阿托伐他汀组MDA含量在术后2 h升高，6 h、10 h无明显变化，于24 h再度回升并分别达到峰值(8.22±0.54)nmol/mgprot和(6.32±0.35)fnmol/mgprot。在 2 h、6 h、10 h、24 h，阿托伐他汀组MDA含量均低于脓毒症组，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。见图2。

图2 各组肝组织匀浆丙二醛水平的比较

2.3 光学显微镜检查 心脏:对照组无明显病理改变或间质血管充血(图3A)。脓毒症组部分心肌变性，血管充血明显(图3B)。阿托伐他汀组少量心肌变性，间质血管充血(图3C)。肺:对照组肺泡间隔无增宽，无炎性细胞浸润(图4A)。脓毒症组肺泡间隔明显增宽，淋巴细胞、浆细胞浸润，血管扩张充血，其周围炎细胞浸润明显(图4B)。阿托伐他汀组肺泡间隔略增宽，少量淋巴细胞、浆细胞浸润(图4C)。空肠:对照组肠粘膜正常(图5A)。脓毒症组肠粘膜部分上皮脱落，重度炎症(图5B)。阿托伐他汀组肠粘膜中度炎症(图5C)。肝脏:对照组无明显病理改变或肝细胞轻度水肿，汇管区少量淋巴细胞浸润(图6A)。脓毒症组肝细胞高度水肿、变性(图6B)。阿托伐他汀组肝血管略充血，肝细胞水肿较轻(图6C)。

3 讨论

本次试验采用CLP复制脓毒症大鼠模型［17－18］。CLP模型操作简单，通过外科处理使动物腹腔存在失活组织的同时，少量持续溢入混有多种细菌的肠内容物，引起腹腔感染，与临床上阑尾炎穿孔形成的憩室炎极为相似［19－20］，既可以使脓毒症得到充分发展，也可以保证脓毒症大鼠模型在24 h内的存活率。进入腹腔的细菌释放，刺激单核细胞、巨噬细胞和内皮细胞等产生多种促炎细胞因子，可迅速活化不同组织器官的细胞，导致机体代谢、激素水平和神经内分泌改变，造成细胞功能异常和器官功能衰竭。内毒素也激活生理状态下没有活性的诱导型一氧化氮合酶(iNOS)并大量表达，产生过量的NO，促使大量的中性粒细胞活化，引起“呼吸爆发”，产生大量的氧自由基，促进炎性渗出和组织损伤。MDA是体内自由基代谢产生的脂质过氧化产物，可以反映脂质过氧化自由基的存在及反应的程度［21］。他汀类药物能抑制iNOS的表达，下调NO的合成，从而改善脓毒症的预后。

本次试验中，脓毒症组血浆NO浓度在术后6 h显著升高，24 h达到峰值(329.04±21.15)μmol/L。在阿托伐他汀干预后，血浆NO的浓度在术后10 h才显著升高，术后24 h达到峰值(209.53 ±10.68)μmol/L。在6 h、10 h、24 h时间点，阿托伐他汀组大鼠血浆中NO的浓度较脓毒症组明显降低(P＜0.01)。阿托伐他汀可以降低脓毒症大鼠血浆中NO的浓度。在脓毒症组，术后24 h肝组织匀浆MDA含量的峰值为(8.22±0.54)nmol/mgprot，阿托伐他汀组为(6.32±0.35)nmol/mgprot，在术后 2 h、6 h、10 h、24 h，阿托伐他汀组肝组织匀浆MDA含量均低于脓毒症组(P＜0.05或P＜0.01)，说明阿托伐他汀也可以降低脓毒症大鼠肝组织匀浆中MDA的含量。与脓毒症大鼠高浓度的NO和MDA相对应，24 h后光镜下检查发现，脓毒症组心脏﹑肺﹑肝脏﹑空肠有明显病理改变，炎细胞浸润，组织充血、坏死、渗出，表现为重度炎症，提示脓毒症时心脏﹑肺﹑肝脏﹑空肠都可能受累。阿托伐他汀干预后，心脏﹑肺﹑肝脏﹑空肠光镜下的病理改变较脓毒症组有一定程度的改善。说明阿托伐他汀可能减轻脓毒症大鼠模型的炎症反应，因此，推测在脓毒症患者中应用他汀类药物可能具有一定的临床意义。

图3 光学显微镜下大鼠心脏24 h病理改变(HE×400)

图4 光学显微镜下大鼠肺脏24 h病理改变(HE×200)

图5 光学显微镜下大鼠空肠24 h病理改变(HE×200)

图6 光学显微镜下大鼠肝脏24 h病理改变(HE×200)

“拯救脓毒症战役”(SSC)会议推荐早期集束化治疗:液体复苏，血管活性药物，控制血糖，小剂量激素，机械通气以及重组人体活化蛋白 C(rhAPC)用于治疗脓毒症休克等，但目前仍没有特效治疗方法。虽然FDA批准他汀类药物仅作为调脂及抗动脉粥样硬化使用，也许它的保护作用可以给我们新的启发和思路。

［1］李轶男，周立新，誉铁鸥，等.ICU重度脓毒症患者死亡危险因素分析［J］.实用医学杂志，2007，23(24):3875－3877.

［2］周卿，陈天适，刘晓红，等.阿托伐他汀对老年冠状动脉严重病变患者左心室功能的影响［J］.中国医药，2010，5(1):1－4.

［3］Kumana CR，Cheung BM，Lauder IJ.Simvastatin reduced mortality and vascular events in high－risk patients［J］.ACP J Club，2003，138(1):2－3.

［4］Cannon CP，Braunwald E，McCabe CH，et al.Intensive versus moderate lipid lowering with statins after acute coronary syndromes［J］.N Engl J Med，2004，350:1495－1504.

［5］吉世军.阿托伐他汀治疗急性冠脉综合征的疗效［J］.实用药物与临床，2011，14(1):79－80.

［6］曹东来，王志强，韩冷，等.阿托伐他汀对急性冠脉综合征患者血清炎性指标的影响［J］.中国临床医学，2010，17(6):791－792.

［7］丁颖.阿托伐他汀短期治疗对脑梗死患者血脂和炎性标志物表达的影响［J］.中国临床医学，2007，14(2):158－159.

［8］吴晓琰，陆怡，施小梅.阿托伐他汀治疗老年人代谢综合征［J］.中国临床医学，2008，15(4):459－461.

［9］刘时武，王喜玉，马建林，等.瑞舒伐他汀对高胆固醇血症患者炎症细胞因子的影响［J］.实用医学杂志，2010，26(13):2419－2421.

［10］余慧文，蒋作锋，韦建瑞.阿托伐他汀钙对高血压病患者血脂异常的疗效及对高敏C反应蛋白的影响［J］.中国医药，2011，6(4):393－394.

［11］施中平，林斌，王军.阿托伐他汀对代谢综合征患者部分炎症因子的影响［J］.实用医学杂志，2010，26(19):3625－3626.

［12］Bustos C，Hernández－Presa MA，Ortego M，et al.HMG－CoA reductase inhibition by atorvastatin reduces neointimal inflammation in rabbit model of atherosclerosis［J］.J Am Coll Cardiol，1998，32(7):2057－2064.

［13］Pruefer D，Scalia R，Lefer AM.Simvastatin inhibits leukocyteendothelial cell interactions and protects against inflammatory processes in normocholesterolemic rats［J］.Arteioscler Thromb Vasc Bio，1999，19(12):2894－2900.

［14］Laufs U，Liao JK.Post－transcriptional regulation of endothelial nitric oxide synthase mRNA stability by Rho GPPase［J］.J Biol Chem，1998，273(37):24266－24271.

［15］燕晓雯，李维勤，黎介寿，等.通过改变盲肠结扎长度制造不同感染程度的大鼠盲肠结扎穿孔模型［J］.中华实验外科杂志，2007，24(11):1340.

［16］刘福英，刘田福.实验动物学［M］.北京:中国科学技术出版社，2005:209－210.

［17］乐胜，张舜玲，刘志红，等.p38丝裂原激活蛋白激酶抑制剂对脓毒症鼠心肌损伤的保护作用［J］.中国医药，2009，4(5):324－316.

［18］吕杰，杨劲松，安友仲.活血中药对大鼠脓毒症早期循环及活化蛋白 C 的影响［J］.中国医药，2010，5(3):212－214.

［19］朱雪琦，刘清泉，姚永明.脓毒症动物模型制备方法的研究进展［J］.中国危重病急救医学，2006，18(2):114－116.

［20］李文娟，颜亮，李经华，等.脓毒症大鼠生命体征变化的低应激连续观察［J］.实用医学杂志，2008，24(4):531－533.

［21］Gawel S，Wardas M，Niedworok E，et al.Malondialdehyde(MDA)as a lipid peroxidation marker［J］.Waid Lek，2004，57(9－10):453－455.