瘦素对L-02肝细胞甘油三酯沉积及乙酰辅酶A羧化酶表达的影响

周红宇，阳学风

非酒精性脂肪肝(NAFLD)是一种肝组织学改变的临床病理综合征，与酒精性肝病相类似，但与饮酒无明确关系。根据其病理学改变及临床表现，分为单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝纤维化、脂肪性肝硬化［1］。肝脏所含脂质绝大部分为甘油三酯，各种致病因素均可导致肝细胞内甘油三酯(TG)异常堆积，从而导致FLD的发生。

瘦素是肥胖基因(Obese gene)编码的蛋白产物，受体广泛分布于脂肪、骨骼肌、肝脏、心、肺、胰、卵巢、睾丸等组织。瘦素通过与受体结合发挥作用［2］，调节机体脂肪的稳定，抑制食欲、增加能耗和减少体重可能是瘦素的主要作用。本文以人肝L-02脂肪变细胞模型，通过油红“O”染色、RTPCR等方法，对瘦素作用后的脂肪变细胞进行研究，了解瘦素与NAFLD的关系，并初步探讨瘦素对其的治疗作用。

1 实验方法

1.1 非酒精性脂肪变肝细胞模型的建立 人肝L-02细胞株培养接种于50mL培养瓶中，在含体积分数10%的灭活胎牛血清、100 U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的 1640完全培养基中，于37℃，5%CO2培养，饱和湿度，贴壁生长。待细胞长满80%瓶底，消化液消化传代。在更换新鲜培养液后加入胎牛血清，使其浓度为50%，继续培养24 h，形成非酒精性肝细胞脂肪变性模型。

1.2 造模是否成功的判断 Lillie氏油红-O染色:将细胞培养于有无菌盖玻片的6孔培养板，用PBS冲洗盖玻片5min(×3次)，50%异丙醇固定1min，油红“O”染色10min，蒸馏水冲洗1min(×3次)，苏木素染色5min，分色和返蓝后，HPIAS-1000型图像分析系统收集图像。

1.3 RT-PCR法检测人肝L-02乙酰辅酶A羧化酶(ACC)mRNA的表达 以 lμg逆转录产物(cDNA)为模板，通过半定量RT-PCR，以三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内参照。

2 结果

2.1 人肝L-02细胞脂肪化 正常细胞(图1)用50%胎牛血清培养基培养24 h后，用油红“O”染色，显微镜下观察，细胞浆内有大量脂滴存在，符合脂肪化肝细胞特点(图2)。

图1 正常肝细胞(油红‘O’×400)

图2 模型组(油红‘O’×400)

2.2 不同瘦素剂量干预后脂肪化人肝L-02细胞的变化 脂肪化人肝L-02细胞分别用10－7mol/L、10－6mol/L、10－5mol/L 瘦素 +1640 完全培养基培养24 h后，用油红“O”染色，显微镜下观察，脂肪化程度逐渐减轻，见图3～图5。

图3 模型组+瘦素10－7mol/L组(油红‘O’×400)

图4 模型组+瘦素10－6mol/L组

2.3 瘦素对人肝L-02脂肪变细胞乙酰辅酶A羧化酶mRNA表达的影响 用RT-PCR检测人肝L-02细胞乙酰辅酶A羧化酶mRNA的表达。结果显示，经瘦素处理的人肝L-02细胞乙酰辅酶A羧化酶mRNA的表达与瘦素呈浓度依赖性递减。模型组、10－7mol/L、10－5mol/L 及10－5mol/L 瘦素处理组目的基因及GAPDH基因灰度值比值分别为0.867、0.745、0.642、0.512，正常组及正常细胞加瘦素组分别为0.460及0.437，见图6。瘦素处理组与模型组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。

图5 模型组+瘦素10－5mol/L组

图6 不同浓度瘦素处理对人肝L-02脂肪变细胞ACCmRNA表达的影响(灰度值)

3 讨论

近年来，随着生活水平的提高，饮食结构的变化，检测手段的提高，非酒精性脂肪肝(NAFLD)发病率呈逐年上升趋势。自1994年起，一系列研究结果表明，NAFLD的发病无性别差异，在非肥胖和糖尿病人群中也有较高的发病率。特别是发现NAFLD可进展至肝炎、肝纤维化和肝硬化之后［3-4］，逐渐为人们所重视。约75%的2型糖尿病患者可发生不同形式的NAFLD;70%的肥胖患者发生脂肪肝，其中18%出现 NASH［5］。NAFLD的发病机制尚不十分清楚，人们广泛认同Day等［6］提出的“二次打击”理论。多因素联合作用诱发胰岛素抵抗(IR)，后者通过增加脂肪分解和FFAs转运至肝脏导致第一次打击—脂肪肝形成，并造成肝脏对第二次打击的敏感性增强。氧应激、脂质过氧化等进一步促进IR，加重氧应激和肝细胞损伤，导致炎症反应、肝细胞变性和肝纤维化，即第二次打击。本研究结合文献方法［7］，用高脂培养基造模，形成典型的非酒精性脂肪肝细胞模型，主要研究NAFLD形成的第一步肝细胞内脂肪沉积及瘦素干预后的变化。

肝脏是体内参与脂质代谢的重要场所。肝脏脂质代谢稳态的变化是构成各种形式脂肪肝的基础，各种致病因素可通过一个或多个环节导致肝细胞内TG异常堆积。肝细胞不能储存脂肪，TG在肝细胞内，一方面氧化分解供能，另一方面与载脂蛋白B100、载脂蛋白C等以及磷脂、胆固醇结合生成极低密度脂蛋白(VLDL)，由肝细胞分泌通过血液循环运输至肝外组织。当肝细胞合成TG增多，TG转运或氧化障碍时，均可导致TG的堆积，形成脂肪肝。

本实验发现肝细胞普遍发生脂肪变性，细胞肿胀，内含较大的脂肪滴，可将细胞核挤压向胞膜，表明高脂环境可引起肝脏脂肪浸润(TG贮存)。而经过瘦素处理后，肝细胞内脂滴明显减少，细胞形态恢复正常，与瘦素呈剂量依赖性关系。说明10－7～10－5mol/L浓度的瘦素对离体脂肪变肝细胞有积极的防治作用。

瘦素是一种主要由白色脂肪组织分泌合成、由167个氨基酸残基组成的蛋白质类激素［8］。主要在白色脂肪组织中表达，通过靶细胞膜上的受体及相应的信号转导体系发挥作用。OB-Rb主要存在于下丘脑中能表达NPY的细胞表面，与瘦素结合后，通过Janus激酶(JAK)以及信号转导和转录激活物(STAT)蛋白发挥信号转导作用，调控核内DNA上leptin效应基因的转录活性。瘦素与特异性运输蛋白结合，通过血脑屏障后与下丘脑特异受体结合，把体脂信号传递给下丘脑。下丘脑再通过一系列神经体液因素调节机体能量代谢，调整体脂，控制体重相对恒定［9］。给OB小鼠脑脊液中注入瘦素后［10］，进食明显减少，体重逐渐下降，减少的仅为脂肪组织，且基础代谢率有所升高，说明抑制食欲、增加能耗和减少体重可能是瘦素减肥的主要机制。

瘦素可能从外周直接拮抗肝脂肪变性。瘦素可以激活AMP活化蛋白激酶，减少脂肪沉积［11］，还可特异性抑制肝脏的硬脂酰基-辅酶A去饱和酶，使肝脏 VLDL生成和脂肪沉积减少［12］。Unger等［13］认为，非脂细胞瘦素受体发生功能障碍时，细胞内TG含量能增加100倍，而持续表达的异位高瘦素血症能使细胞内TG耗竭;瘦素还干预胰岛素在肝脏中的作用，一方面拮抗胰岛素诱导的PEPCK下调，抑制胰岛素受体底物-1(IRS-1)的磷酸化，影响胰岛素受体后信号转导;另一方面，瘦素通过对PEPCK及糖异生的影响，限制TG的合成，提高肝脏及外周组织对胰岛素的敏感性。Stumvoil等［14］发现，瘦素与脂联素等连用，能促进小鼠肝脂肪燃烧及能量消耗，可逆转缺乏过氧化物酶体增殖受体(PPAR)α的脂肪萎缩小鼠的胰岛素抵抗。

本实验证实细胞内TG明显增加，经过瘦素处理后，肝细胞内TG明显减少，与瘦素呈剂量依赖性关系。说明瘦素能明显减少离体脂肪变肝细胞的TG沉积，与文献［12-15］报道一致。本实验显示，瘦素对离体脂肪变肝细胞具有降低细胞内脂肪沉积的作用，对TG的作用明显。同时，本实验通过油红“O”染色显示，瘦素处理后脂肪变肝细胞内TG量明显减少，瘦素可抑制乙酰CoA羧化酶的表达而抑制TG的合成，可见瘦素可使离体肝细胞内TG合成减少，减少TG沉积，从而减轻肝细胞脂肪化程度。但其对人类非酒精性脂肪性肝脏疾病是否具有治疗意义，以及具体作用机制，有待进一步研究。

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