建立新西兰白兔深静脉血栓模型的实验研究

郑玉江，汤庆，邓方阁，张浩

深静脉血栓形成(deep venous thrombosis,DVT)多见于下肢，严重危害人类的生命与健康。DVT的动物模型是研究体内静脉血栓形成发病机制和评价相应治疗方法的重要工具。DVT形成的三要素为血流缓慢、血管壁损伤、血液高凝状态[1]。本实验采用同时满足上述条件来激活凝血系统，形成稳定血栓，构建兔DVT模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物 普通级健康新西兰大白兔8只，雌雄不限，体重约2.0～2.5 kg，由中山大学实验动物中心提供(合格证号：0070409)。实验前正常饲养1周。采用自身对照研究，任意选择一侧股静脉为实验组，对侧股静脉为对照组。

1.2 模型制备 3%戊巴比妥钠1 ml∕kg兔耳缘静脉注射麻醉，密切观察其心率和呼吸变化。将兔仰卧位固定，双侧后肢内侧区备皮、消毒。沿右(或左)下肢近端沿股静脉的走向，做长约4 cm的斜形皮肤切口，分离皮下及肌肉组织，可见股动脉、股静脉及股神经相伴行。小心分离股静脉，避免撕裂管壁。游离股静脉约2 cm，血管夹夹闭近心端，以无齿镊钳夹远端血管壁10次，在血管夹远心端约1 cm处用1 ml注射器平行向心插入股静脉，注入0.1 ml凝血酶(终浓度150 U∕ml，湖南一格制药有限公司生产)，迅速退出针头，按压针孔处数分钟。血管夹保留2 h，期间不定时向组织滴加生理盐水以保持湿润。2 h后缓慢取出血管夹，分层缝合肌肉与皮肤。对照侧肢体不做处理。肌注硫酸庆大霉素40000 U(湖北天药药业股份有限公司)。术毕，手术侧肢体加小夹板行石膏绷带固定于屈髋屈膝位，放回兔笼继续饲养48 h。模型制备后每天观察实验兔的一般状态并记录。

1.3 彩色多普勒超声检测 SEQUOIA-512型彩色多普勒超声诊断仪(德国西门子公司，实时凸阵探头，频率10 MHz，可自动计算流速)对兔的双侧股静脉进行二维、彩色多普勒(CDFI)及频谱多普勒(PW)超声扫查，观察血栓形成及静脉血流情况。

1.4 病理学检查 模型制备后48 h，静脉注入过量戊巴比妥钠溶液处死动物。取血栓形成节段及对侧正常节段股静脉血管置于10%中性福尔马林溶液中固定，48 h后石蜡包埋，横切血管段制成病理切片，经苏木精-伊红染色，置显微镜下观察血栓形成情况。

2 结果

图1 DVT模型彩色多普勒超声检测

2.1 一般状态 8只兔均存活，未出现静脉血管损伤破裂出血等严重并发症以及呼吸困难、气促、呛咳、休克等肺动脉栓塞症状，精神尚可，下肢活动受限。其中3只兔手术侧肢体明显肿胀伴发热。

2.2 超声检测 见双侧股静脉管腔均表现为无回声。探头加压，实验侧股静脉不能被压瘪，对照侧可压瘪。CDFI及PW示实验侧静脉管腔内无彩色血流及血流频谱信号，对照侧可见充盈管腔的彩色血流信号及随呼吸变化的血流频谱(图1)。

2.3 病理学检查 8只动物均成功建立股静脉血栓模型，4只位于左侧，4只位于右侧。血栓段股静脉肉眼下见血栓充满静脉管腔，呈紫红色，与管壁无粘连。光镜下可见血管内皮细胞不完整以及均质粉染的血栓，血栓主要为均匀分布的红细胞，其间可见纤维素网状结构及散在血小板及白细胞。对照侧股静脉血管内膜表面光滑、平整，未见血栓形成(图2)。

图2 DVT模型的病理检测

3 讨论

DVT是临床常见疾病，发病率在国内外均呈逐年增多趋势，具有很高的致残率及致死率[2-3]。目前关于DVT形成的危险因素也不断补充和完善，如年龄、肥胖、静脉曲张、吸烟、髂动脉压迫综合征等[4]；这些危险因素可相互叠加、相互影响[5]，最终导致血流滞缓，血管内皮缺氧、受损，血液高凝，从而促使DVT的发生。

在本实验中，我们选择新西兰白兔进行DVT模型制备，因为与鼠等小型动物相比，兔的股静脉压力较高，血流量较充足，且血栓形成迅速，并可充盈整个血管腔，易于观测；同时新西兰白兔比起犬、猪等大型动物，其价格经济，性情温顺，易于超声检查。

目前，单纯静脉结扎是制备血栓模型的确切方法，但较为耗时[6]。本实验采用注入凝血酶以加快血栓形成。当血管夹在近端阻滞股静脉后，在股静脉远端注入凝血酶。由于凝血酶注入后可使静脉管腔张力增加，管壁由原来的淡粉色变成半透明色，当注射针孔经过短暂几分钟的压迫后即可止血，并迅速形成肉眼可见的血栓。在血栓形成后0.5 h，暗红色的血栓逐渐向近心端蔓延，表明本实验制备DVT模型时在近端阻滞静脉，远端注入凝血酶的方法可行，不仅可形成确切的血栓，还有效地提高建模的成功率。这与文献报道相一致[6]。

术后48 h实验侧股静脉病理结果示管腔内血栓充盈，血管内皮细胞不完整，炎性细胞浸润，血栓与管腔无粘连，这与文献报道基本一致，同时也符合人体DVT急性期病理表现[7-8]。由于这个时候血栓尚未与血管壁发生机化、粘连，采用溶栓疗法和取栓术均能取得满意的效果[9]。

本实验术后的肢体制动也很重要。因为形成初期的静脉血栓与管壁粘连不紧，质地松脆，活动或按压肢体易使血栓脱落导致肺栓塞。新西兰白兔虽然是较温顺的动物，但喜咬啮，单纯的石膏绷带达不到固定的目的，故我们采用小夹板与石膏绷带共同固定的方法。

[1]Torbicki A,Perrier A,Konstantinides S,et al.Guidelines on the diagnosis and management of acute pulmonary embolism:the Task Force for the Diagnosis and Management of Acute Pulmonary Embolism of the European Society of Cardiology(ESC)[J].Eur Heart J,2008,29(18):2276-2315.

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[3]Wojcik BM,Wrobleski SK,Hawley AE,et al.Interleukin-6:A potential target for post-thrombotic syndrome[J].Ann Vasc Surg,2010,[Epub ahead of print].PMID:21131172.

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[7]张惠明,张力.简易悬吊术制备大鼠深静脉血栓模型[J].现代中西医结合杂志,2009,18(17):1979-1980.

[8]陆慰萱,刘春萍.深静脉血栓形成和肺血栓栓塞症的自然病程[J].中华医学杂志,2003,83(1):84-86.

[9]孟申,王方永.地震创伤后下肢深静脉血栓形成与肺栓塞防治[J].中国康复理论与实践,2008,14(7):662-664.