RELN基因单核甘酸多态性与儿童孤独症临床特征的相关分析

孙颖，盛昭明，刘明远，杨利敏，李兴洲，姜志梅

儿童孤独症是一种较为严重的发育障碍性疾病，多于3岁前发病，男孩比女孩多见。它的基本特征是不同程度的言语发育障碍、人际交往障碍、兴趣狭窄和行为方式刻板。孤独症的病因涉及环境和遗传因素，家系研究和双生子研究证实遗传因素在孤独症发病中起关键的作用。

RELN基因定位在孤独症的易感基因座位7q22，编码的reelin蛋白在与脑发育相关的神经元迁移和定位过程发挥重要作用。国外已进行许多该基因与孤独症的关联研究，但有关研究得出的结论不一。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2006年1月～2007年12月佳木斯大学附属第三医院发育与行为儿科收治孤独症患儿30例，均为汉族，其中男性24例，女性6例；年龄3～12岁。同期选取佳木斯幼儿园和小学的健康儿童30例为对照组，其中男性24例，女性6例；年龄3～12岁。两组儿童性别及年龄无显著性差异(P＞0.05)。

1.2 诊断标准 所有患儿符合美国《精神障碍诊断和统计手册》第4版(DSM-Ⅳ)规定的儿童孤独症的诊断标准[2]。

1.3 纳入标准

1.3.1 病例组 ①年龄3～12岁汉族儿童；②完全符合儿童孤独症的诊断标准；③孤独症儿童行为检查量表(Autism Behavior Checklist，ABC)评分≥67分；儿童孤独症评定量表(CARS)评分≥30分；④家长知情同意。

1.3.2 对照组 ①年龄3～12岁，与相应匹配的病例组儿童的年龄相差不超过0.5岁；②与病例组相应匹配儿童的性别相同；③汉族；④孕期及出生时正常；⑤与病例组儿童无血缘关系；⑥家长知情同意。

1.4 排除标准 全面体格检查和神经精神检查后认为该名儿童可能存在已知病因的发育障碍或其他神经精神疾病，包括精神发育迟滞、其他广泛性发育障碍。

1.5 检测方法 每名研究对象抽取静脉血2 ml置于EDTA抗凝管内，摇匀后立即－20℃冻存。使用DNA提取试剂盒提取DNA。

RELN基因exon 6 SNP的基因分型采用聚合酶链式反应技术。PCR引物如下：

正向5′-ACA GCA TGT TGG CAC TTG TG-3′反向5′-TTG GTG GTA GGA GTC AAA GT-3′

用大连宝生物公司的TaKaRa TaqTM试剂盒扩增。PCR反应液共25 μl，内含基因组DNA、引物、Taq酶、缓冲液、dNTPs。PCR条件：95℃预变性10 min，继以94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40个循环，72℃终末延伸8 min。经PCR仪扩增后产物为135 bp，由内切酶PvuⅡ酶切后产生79 bp和56 bp两个片断，组成3种基因型：A/A（135 bp/135 bp），A/G（135 bp/79 bp/56 bp），G/G（79 bp/56 bp）。

1.6 统计学方法 应用统计分析软件SPSS 11.5计算不同基因型在不同组间的分布情况。

2 结果

2.1 RELN基因exon 6 SNP基因型分布 A等位基因PCR产物不含PvuⅡ酶切位点，只有一个长度为135 bp的片段。G等位基因PCR产物含PvuⅡ酶切位点，酶切后产生长度分别为79 bp和56 bp的片段。根据电泳结果，exon 6 SNP A/A基因型为一条长135 bp的条带，A/G基因型为3条长度为135 bp、79 bp和56 bp的条带，G/G基因型为两条长79 bp和56 bp的条带（图1）。

2.2 基因型和等位基因频率 χ2检验显示基因型及等位基因频率分布符合H-W平衡法则。儿童孤独症组与对照组exon 6 SNP基因型和等位基因频率存在显著性差异(P＜0.05)。见表1。

图1 exon 6 SNP基因型分型电泳图

表1 两组exon6 SNP基因型与等位基因频率

2.3 基因型与临床特征的关系 单因素方差分析显示，不同基因型孤独症儿童ABC总分及交往因子得分存在非常显著性差异（P＜0.01)；经进一步LSD分析，在基因型为A/A和A/G、A/A和G/G孤独症儿童之间，交往因子存在显著性差异(P＜0.05)，基因型为A/G和G/G之间ABC总分存在显著性差异(P＜0.05)。见表2。

2.4 病情严重程度与exon 6 SNP的关系 重度与轻中度孤独症组exon 6 SNP基因型及等位基因分布存在显著性差异(P＜0.05)。见表3。

2.5 不同基因型儿童CARS得分的比较 单因素方差分析显示，不同基因型的孤独症儿童模仿、听觉反应、非语言和总分存在显著性差异(P＜0.05)；LSD分析，在基因型为A/A、G/G的孤独症儿童之间在模仿、听觉反应和CARS总分存在显著性差异(P＜0.05)；在基因型为A/A和A/G、A/A和G/G的孤独症儿童之间，非语言存在显著性差异(P＜0.01)。见表4。

表2 exon 6 SNP不同基因型ABC得分的比较(n=30)

表3 孤独症组CARS评分重度组与轻中度组exon 6 SNP比较

表4 不同基因型CARS评分比较

3 讨论

基因组筛查和细胞遗传学研究显示，7q存在孤独症易感基因座位[1-5]。RELN基因定位在7q22[6]，其表达产物reelin蛋白为3461个氨基酸残基组成的巨大基质外糖蛋白，与神经元的正确迁移以及大脑皮层、小脑皮层和海马等分层结构的正确形成有关。

研究表明，与reelin蛋白有关的任一自然突变或定向突变会影响小鼠大脑皮层分层结构的形成，导致胚胎脑的发育异常。RELN基因突变导致reelin表达异常。研究发现，孤独症患者脑组织和血中reelin水平比对照下降。孤独症患者存在海马、内嗅皮质、杏仁核、扣带回皮质神经解剖异常，包括神经元大小和数目的改变。海马回负责学习和记忆，孤独症患儿的社会行为退缩、强迫行为、不知危险、不能从记忆库存中提取信息、不能调节自己以适应新环境均与海马回受损有关；损伤海马回的动物可以出现刻板行为、自我刺激行为和多动行为。

本研究提示，exon 6 SNP与儿童孤独症的严重程度有关：携带基因型为G/G的患儿比携带基因型A/A的患儿模仿和听觉反应能力差，携带基因型为G/G、A/G的患儿比携带基因型A/A的患儿有更严重的非语言交流障碍。

Weeber等报道，RELN和ApoER2基因共同作用提高海马的突触可塑性和学习能力[10]。RELN基因突变与人[11]和鼠[12]学习障碍、小脑发育不全、共济失调和认知障碍明显相关。

本研究结果与其他学者不一致可能由遗传异质性导致，因为儿童孤独症是多基因复杂性疾病。也可能由于本研究样本量较小，进一步研究应扩大样本量并进行家系研究。

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