同体非血管化游离骨移植中骨形成的实验研究

尹禄，潘慧，韩泽民，刘宝林

自体骨移植是修复颌骨缺损的主要手段之一。在血管化和非血管化游离骨移植修复颌骨缺损的比较中，非血管化骨移植在临床应用中有着自己的特点和一定优势，并已成功地应用到临床实践中。非血管化游离移植骨块在体内的改建问题，国内外各家的报道存在着不尽相同的观点[1-3]。本实验通过观察不同离体时间点的非血管化游离骨块植入体内后的细胞成活和成骨情况，探讨非血管化游离骨块的离体时间与植入体内后骨成活之间的关系。

1 材料与方法

1.1 实验材料 天津地区成年杂种狗8只，体重18～25 kg，雌雄不限。按实验目的分为两组，A组为离体40 min实验组，B组为离体120 min实验组。全麻药为苏眠新Ⅱ(长春兽医研究所)；动物实验用手术器械。骨折固定用金属钛板(西安中邦钛生物材料公司)。甲酸、多聚甲醛、PBS缓冲液、APES(3-aminopropyl-Triethoxysilane)：Sigma公司。组织学HE染色和改良Mallory染色的相关试剂。光学显微镜：Olympus。

1.2 实验方法 全身麻醉下拔除狗的下颌前磨牙，缝合拔牙床牙龈黏膜，在拔牙术后1个月，牙龈黏膜可以达到组织上的愈合，在截除下颌骨分离时不易穿通口腔。取下颌骨下缘切口，在拔牙区节段性截除下颌骨长约3.0 cm的骨段。取对侧包括髂前上嵴的髂骨全层骨段，长度略大于3.0 cm，去除附着于骨上的肌腱等软组织；分别在离体40 min、120 min内植入下颌骨缺损的受植区。成型板和小钛板固定，生理盐水冲洗术区，严密缝合术区切口。

1.3 标本处理及检测方法 A、B两组动物均在种植体植入术后4周和8周取出原植入的髂骨块，X线检查骨吸收及种植体位置情况。用金刚砂片沿种植体长轴纵向剖开骨质后，观察大体标本，比较两组标本的差别。取材厚度为5.0 mm，4%多聚甲醛固定，蒋氏固定和脱钙液进行组织脱钙[4]，脱水后，石蜡包埋。石蜡切片厚8 μm，做HE和蒋氏改良Mallory法染色，观察骨块内细胞和新骨形成情况。

2 结果

2.1 大体观察 骨移植术后4周，A组动物植骨块与下颌骨缺损处两断端间有轻度的活动度，可见骨痂形成，接触端成凸起状，硬度较小，手术刀可切开；外层有较多的软组织包绕，易出血、易剥离。B组植骨块与下颌骨缺损处的两断端间未见明显骨痂形成，外层包绕的软组织较少。

骨移植术后8周，A组植骨块与下颌骨缺损处已连成一体，连接处稍凹，略低于两侧的骨面，两断端间无动度，手术刀切不开；外层包绕的软组织少而致密，从骨面不易剥离。B组植骨块与下颌骨缺损处的连接处可见少量骨痂形成，手术刀可切开，植骨块有轻度的动度，有明显吸收；外层包绕的软组织较多，易出血，也容易剥离。

X线检查，A组植骨块吸收较少，骨吸收主要集中在植骨块的下缘，B组骨块明显吸收。

2.2 组织学观察 A组在术后4周和8周，移植骨块内均可见成活的骨细胞，骨陷窝内有细胞核，偶见多核的破骨细胞(图1)；术后8周能见到低密度的新骨形成，有些部位还可以见到数目不等岛状软骨和软骨向编织骨过渡的现象(图2)。B组术后4周和8周，移植骨块内均未见到成活的骨细胞，骨陷窝内空虚，多核的破骨细胞常见，图象显示为死骨，无新骨形成现象，也没有见到软骨的形成(图3)。

图1 A组HE染色(200×)

图2 A组改良Mallory法染色(100×)

图3 B组HE染色(200×)

3 讨论

自体非血管化游离骨移植是目前临床上修复颌骨缺损的主要方法之一[5-6]。一百多年来，对于大块骨缺损修复时骨块成活及成骨能力的研究，使得自体非血管化游离移植骨的归宿成为人们最为关注的问题。单纯非血管化的游离骨移植后骨块的组织学变化最开始被描述为“爬行替代”[1]。因此，不少人认为非血管化游离骨块植入体内后是死骨，没有成骨能力，只能作为新骨形成的支架。骨缺损修复过程是植入的非血管化游离骨块逐渐被吸收，其修复的骨缺损空间则由植入床周围组织形成的新骨替代，是“爬行替代”学说的核心理论。以往的研究对非血管化游离骨块离体时间的因素考虑较少。

近年来临床实践中遇到的一些现象对该理论提出了挑战。刘宝林等在非血管化游离骨移植同期植入种植体修复下颌骨缺损的病例中发现，离体时间与种植体的骨结合成功率有着密切联系[7]。牙种植成功的关键是种植体与骨形成良好的结合，有生命活力和正常新陈代谢的骨有利于种植体形成骨结合。因此推测非血管化游离移植骨块是否成活对同期植入种植体与骨组织能否形成结合至关重要。

Stroud等认为，在新骨形成中有3个作用：骨引导、骨诱导及提供成骨细胞[8]。

骨传导：一方面由破骨细胞吸收坏死的植骨块，另一方面由宿主骨床的骨外膜、骨内膜、骨髓和周围的软组织向坏死的植骨块内长入血管间充质细胞、软骨细胞、成骨细胞和骨细胞，产生软骨和骨组织以取代坏死骨而使植骨块愈合。因此植骨块的主要作用是起支架作用，以利宿主骨床血管和骨系细胞的长入。从骨引导作用来看，双端受植床有利于植骨块的愈合及尽快完成骨的改建和重建[9]。

骨诱导指移植骨刺激周围由宿主来的间充质细胞分化为成骨细胞，形成新骨。单纯骨移植的诱导成骨发生在整个移植区。

提供成骨细胞：营养物质通过小管渗入到移植骨，可使部分成骨细胞存活一定时间。临床上剥离骨膜时仅纤维层被剥离，由成骨细胞组成的生发层仍然附着在骨皮质表面，只要骨保持湿润，或体外不超过2 h，成骨细胞仍可存活。骨内膜表面细胞也有一层相同的成骨细胞，可成活并形成新骨[10]。Craig在定量研究密质骨不同细胞在成骨中的作用后指出，在前4周，新骨形成主要来自移植骨细胞，而在4周后新骨形成主要来自宿主骨[11]。由此看来，移植骨内可以有部分细胞成活，并具有成骨能力。

本研究对狗下颌骨长度为3.0 cm的节段性缺损用游离非血管化髂骨修复，在游离骨块离体40 min内植入受区，骨断端间行坚强内固定，在体内4至8周的时间内，骨连接处先形成骨痂，表明植骨块有骨诱导能力；以后骨痂改建形成骨性连接，移植骨块周围形成新骨，可能表明骨块内有活骨细胞的存在，并有一定的骨形成能力。移植骨块内中心部位多个岛状的软骨细胞群推测是植骨块内松质骨的细胞形成的，因为如果是从周围爬行来的细胞，它们应该从植骨块的周边逐渐向中心形成。移植骨块内软骨的形成是非血管化游离骨块移入体内成活的有力证据。

骨块成活量的多少取决于它的营养状况。在较短的离体时间内，骨内的各种细胞可以靠自身营养储备和对缺氧的耐受程度来维持活力。由于每种细胞对缺氧的耐受性不同，在不同的离体时间点，骨块内活细胞的成分不尽相同，一般来说，同一组织类型的细胞，功能状态活跃和正处于分化状态的幼稚细胞对缺氧的耐受性较低，功能活跃的细胞维持着组织器官的正常形态和功能，幼稚细胞是组织更新的来源，这些细胞死亡意味着组织在移植一定时间后，分化成熟的功能状态细胞完成其使命后，慢慢被机体清除；由于没有新生组织的替补，移植物会逐渐老化、死亡，直至完全被其他组织替代。这种现象可能是“爬行替代”理论形成的基础。

“爬行替代”理论认为，移植骨多在1周后开始吸收，周围的破骨细胞逐渐蚕食、破骨、吸收，清除死骨；3周时有骨改建，即新骨的形成。果真如此的话，早期的破骨细胞应该在死骨的边缘，新骨的形成在破骨细胞的后面。我们的实验在骨连接的界面处并没发现大量的破骨细胞，而是炎症细胞、成纤维细胞和内皮细胞，也有少量的破骨细胞；而在死骨内可以见到数量不少的破骨细胞，这些破骨细胞可能由骨块内的其他有活力的细胞分化而来。这些细胞的出现提示，非血管化游离骨块的营养状况决定着幼稚骨细胞的分化方向：营养充足的骨块，比较原始的细胞向成骨细胞方向分化，形成新骨并维持一定的形态以行使其相应功能；营养差的骨块，活力差，机械强度小，不利于承担重力，原始细胞向破骨细胞方向分化，以清除该骨，待由新骨替代。死骨的形成不完全是骨块内细胞立即死亡，部分成熟的骨细胞可能还存在一定的活力和功能，但其老化后，没有新的骨细胞补充，骨块也就没有了活力。这也是死骨在一定时间以后才能出现相应体征的原因。

非血管化游离髂骨移植的成活可能与髂骨富有松质骨成分的特性有关。①松质骨富于未分化的多潜能细胞，这些细胞在短暂离体缺血的情况下可能分泌某些促血管形成的因子，易于早期建立营养通道；②松质骨多孔隙的特点有利于周围营养物质渗透和营养通道再通。非血管化游离骨移植时离体时间短，缺血缺氧时间短，骨块内的细胞更可能保持活力和功能状态。离体时间对移植骨成活状况有着决定性的影响。

本实验以天津地区的成年健康杂种狗为研究对象，揭示了非血管化游离骨移植时的离体时间与骨块内细胞成活密切相关的现象。实验设定了条件，其结果有一定的局限性，因此还需要更多种属的动物、更长时间的实验观察结果来反复验证。与非血管化游离骨移植细胞成活相关的营养通道重建问题还有待于进一步研究。

[1]Phemister DB.The fate of transplanted bone and regenarative power of its various constituents[J].Surg Gyn,1914,19:303-333.

[2]Busa R,Adani R,Castagnetti C,et al.Neovascularized bone grafts:experimental investigation[J].Micro Surg,1999,19(6):289-295.

[3]徐锦程，卢保全，黄全顺，等.非血管化髂骨移植修复下颌骨缺损的临床应用[J].解剖与临床，2004，9(2)：102-103.

[4]杨连甲,金岩.口腔和骨科的生物活性材料[M].西安：陕西科学技术出版社，1993:62-63.

[5]Kawaguchi K,Sato J,Matsunra M,et al.Clinical study of mandibular reconstruction using vascularized and non-vascularied iliac crest[J].Int J Oral Maxillofac Surg,1997,26(suppl 1):213.

[6]赵晋龙，刘宝林，何黎升，等.非血管化髂骨移植同期种植重建下颌骨节段缺损的临床研究[J].口腔医学研究，2003，19(1)：71-72.

[7]刘宝林.肿瘤术后颌骨缺损的功能重建[J].中华口腔医学杂志，2003，38(1)：9-11.

[8]Stroud SW,Fonseca RJ,Sander GW.Healing of interposition autologous bone grafts after maxillary osteotomy[J].J Oral Surg,1980,38(5):878-888.

[9]唐海阔，赵怡芳.不同骨受植床游离植骨成骨能力比较的实验研究[J].临床口腔医学杂志，2005,21(5)：287-289.

[10]Springfield DS.The osteogeneic phase of regenertion of bone[J].J Bone Joint Surg,1987,69(4):593-600.

[11]Craig G.Early osteogenesis in compact bone isograft:A quantitative study of the contributions of the different graft cells[J].Calcif Tissue Int,1979,29(2):225-237.