蛋白激发子基因peaT1植物表达载体的构建及其转化棉花的研究*

唐宏琨, 曾洪梅, 杨秀芬, 袁京京, 邱德文

(中国农业科学院植物保护研究所,农业部生物防治重点开放实验室,北京 100081)

自1987年Umbeck首次报道通过农杆菌介导法[1],将卡那霉素抗性基因转入棉花以来,棉花转基因研究迅速发展。国内外利用农杆菌介导法已将抗虫、抗除草剂等有价值的目的基因导入棉花,得到了稳定遗传的转基因棉花。我国农业部于1997年批准了转基因棉花的商业化种植,至2007年转基因棉花已占棉花种植面积的60%以上,产生了显著的经济、生态和社会效益。

蛋白激发子是一类能够诱导植物产生防卫反应的信号分子,在植物与病原菌的相互识别中起重要作用。其对病原菌无直接毒杀作用,通过信号传导诱导植物产生乙烯、水杨酸、吲哚乙酸、茉莉酸、植保素和病程相关蛋白等[2-3],调节植物的新陈代谢,激活植物的免疫系统,从而促进植物生长、增强植物抵抗病原菌的能力,有效防止或减轻病害的发生。peaT1是本实验室从极细链格孢(Alternaria tenuissima)中分离出来的蛋白激发子,具有诱导多种植物产生系统抗性、促进植物生长、改善作物品质等作用[4-6]。peaT1的编码基因已被克隆(GenBank登录号为EF030819),在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达蛋白仍具有诱导植物抗旱、促进根系生长等生物活性[7-8]。

关于蛋白激发子转基因植物的研究目前已有报道,并展现出较好的应用前景。Qiu[9]等将蛋白激发子基因pemG1转化水稻和烟草,转基因作物表现出较好的抗病性。邵敏等[10]将来自水稻白叶枯病菌(Xanthomonasoryzae pv.oryzae)的hr f AXoo基因转化水稻,转基因株系中水稻白叶枯病菌的生长明显受到抑制。蒋冬花等[11]将隐地蛋白突变基因CryK 13V整合到烟草基因组中,结果表明转化植株的相关抗病性均有提高。本研究利用农杆菌介导法开展激发子基因peaT1的转基因棉花研究,建立了有效的转基因植株再生体系,获得了再生苗及大量的胚状体,为进一步培育抗病虫、高产优质的棉花品种提供了基础材料。

1 材料与方法

1.1 材料

蛋白激发子基因 peaT1由本实验室从极细链格孢菌克隆获得,质粒pET28a-peaT1由本实验室保存;植物表达载体 pCAMBIA 2300和农杆菌LBA 4404由本实验室保存;中间载体pG4AS-cup由中国农业科学院生物技术所郭三堆研究员惠赠;受体棉花品种‘中棉 24’(‘CCRI24’)由中国农业科学院棉花科学研究所提供。

ExTaq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶、DNA Marker、pMD18-T Simple载体和DNA 片段回收试剂盒均购自大连TaKaRa公司,大肠杆菌感受态细胞DH5 和反转录试剂盒 EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix购自北京全式金生物技术有限公司,质粒小提试剂盒购自天根生化科技有限公司,柱式植物RNAout试剂盒购自天恩泽生物公司,所用引物由英骏生物技术有限公司(Invitrogen)合成。卡那霉素和羧苄青霉素购自AMRESCO公司,其他化学试剂为国产分析纯产品。

1.2 植物表达载体的构建

设计含有 PstⅠ和 XhoⅠ酶切位点的引物primer1(TACTGCAGATGGCCAACCCCCGCATTGAAGAG)和p rimer2(CGCTCGAGCTA TATGCTCAGCGCCATGATGGA),以质粒 pET28apeaT1为模板扩增peaT1序列,引入PstⅠ和XhoⅠ酶切位点。将PCR产物回收后连接pMD 18-T Simp le载体,转化DH5α感受态细胞后提取质粒。将提取的质粒和中间载体pG4AS-cup分别用PstⅠ和XhoⅠ双酶切,连接含有目的基因pea T1的小片段和中间载体片段,得到重组载体pG4AS-peaT1。将重组载体pG4AS-peaT1和pCAMBIA 2300分别用Eco RⅠ和 H in dⅢ双酶切,回收目的片段经T4 DNA酶连接构成植物表达载体pCAMBIA 2300-peaT1。构建好的植物表达载体pCAMBIA 2300-peaT1热激法转化DH 5α感受态细胞,提取质粒用PstⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定目的基因peaT1是否正确插入。采用冻融法将酶切鉴定的植物表达载体pCAMBIA 2300-peaT1转化农杆菌LBA 4404菌株。

1.3 农杆菌介导法转化CCRI24

1.3.1 菌株培养及无菌苗制备

挑取含有目的基因和选择标记基因的单菌落,接种于含50 mg/L卡那霉素和50 mg/L链霉素的YEB液体培养基中,28℃振荡过夜暗培养至对数生长期。用YEB液体培养基稀释菌液,再振荡培养4～6 h,至 A600值为0.5备用。‘CCRI24’棉花种子用硫酸脱绒后,自来水洗掉种子表面硫酸并晾干。70%乙醇表面消毒种子1Min,弃去乙醇,无菌水漂洗。再用0.1%的H gCl2表面消毒30 min,无菌水漂洗4次,种于1/2MS培养基上,28℃,2 000 lx光照培养7 d备用。

1.3.2 共培养

选取发育良好的无菌苗,将其下胚轴切成5～8mm长的茎段,浸泡在预先培养好的农杆菌菌液中。15min后取出,放置在铺有一层滤纸的含有2,4-D、KT和 IAA的 MS培养基上,21℃共培养48 h,然后转移到含有50mg/L卡那霉素、500Mg/L羧苄青霉素的上述培养基上,28℃、2 000 lx、每天光照14 h培养(以下培养条件相同),通过调整激素的浓度以诱导抗性愈伤组织[12-13]。

1.3.3 胚性愈伤及胚状体的诱导

将抗性愈伤组织转移到胚性愈伤诱导培养基上(MS+0.01mg/L 2,4-D+0.01mg/LKT+0.01mg/L IAA),45 d左右继代1次。将米黄色的颗粒状胚性愈伤转移到胚状体诱导培养基上(MS-NH4NO3+KNO3加倍+无激素+Gln 1.0 g/L+Asn 0.5 g/L+活性炭1.0 g/L+AgNO3 40mg/L),30 d继代一次直到出现胚状体[14-15]。

1.3.4 再生苗的培养及嫁接

将诱导出的胚状体转移到再生苗培养基上(MS+IAA 0.1 mg/L+6-BA 0.1 mg/L+G ln 1.0 g/L+Asn 0.5 g/L+活性炭1.0 g/L+AgNO3 40 mg/L),30 d左右继代一次。在装有营养土的土钵中种上普通棉花种子,待子叶完全展开时用作砧木苗。劈接法将再生棉株嫁接到砧木苗上,浇少量水后用透光塑料袋密封嫁接苗,25℃培养7 d左右,慢慢透气炼苗2～3 d即可移栽温室。

1.4 再生苗的分子检测

1.4.1 再生苗的PCR分析

取幼嫩再生棉花叶片,参照CTAB法提取总DNA,用 p rimer1和p rimer2进行 PCR 扩增,验证外源基因的整合情况。

1.4.2 再生苗的southern blot分析

CTAB法提取再生棉株2和4及PCR检测呈阴性的再生苗基因组DNA,用Eco RⅠ充分酶切基因组DNA约16 h,40 V电压下以0.8%琼脂糖凝胶(不加染料)电泳10～12 h,成像后切掉凝胶边角作为标记。参照Southern的方法[16],并结合DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅡ(Roche)说明书,对经PCR检测呈阳性的再生苗进行southern blot分析,以质粒 pCAMBIA-2300-peaT1作为阳性对照,PCR检测呈阴性的再生苗为阴性对照。

1.4.3 再生苗的RT-PCR分析

参照天恩泽柱式植物RNAout试剂盒方法,提取经PCR检测呈阳性棉花植株叶片总RNA,参照全式金EasyScrip t First-Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒合成cDNA,进行RT-PCR分析。

2 结果与分析

2.1 植物表达载体的构建

从转化pCAMBIA 2300-peaT1的大肠杆菌DH 5α中提取质粒,用PstⅠ和XhoⅠ双酶切,如图1所示,酶切所得片段大小与理论值624 bp一致,说明pea T1插入预期位点,载体构建成功,该载体含有加倍增强子元件、和Kozak序列及多联终止密码子序列的表达盒,可以增强目的基因的表达[17]。

图1 重组质粒酶切鉴定

2.2 农杆菌介导法转化CCRI24

2.2.1 抗性愈伤的诱导

经共培养的无菌苗下胚轴切段转移到MS培养基上诱导愈伤组织,抗性愈伤组织的诱导和增殖受激素种类和浓度影响比较大。如表1所示,当只有KT、IAA时,愈伤组织生长缓慢,外植体长根多,只有KT、2,4-D时,愈伤生长快,愈伤多呈绿色硬块状不利于分化。只有2,4-D和IAA时,愈伤表面多呈白色霜状坚硬状态,不易分化。3种激素浓度均为0.1mg/L时,愈伤组织生长速度不是很快,多呈黄白色疏松状态,有利于进一步分化成胚性愈伤。

表1 激素对抗性愈伤诱导的影响

2.2.2 胚性愈伤及胚状体的形成

将灰白色疏松的抗性愈伤组织转移到胚性愈伤诱导培养基上,继代2～3次,可分化出米黄色的颗粒状胚性愈伤组织,将其转移到胚状体诱导培养基上,继代1～2次,诱导出了大量不同形态的胚状体细胞,根据其形态和生长时期分为球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚。

2.2.3 转化苗的再生及嫁接

挑选子叶胚在成苗培养基上继代培养2～3次,可诱导出再生苗,如图2所示。由于棉花组织培养生根比较困难,直接移栽成活率较低,本研究采用劈接法嫁接再生苗。将4棵长出4～5片叶的再生苗嫁接到准备好的砧木上,保湿7 d左右,缓慢透气炼苗3 d移栽温室培养。

图2 棉花转化苗的再生

2.3 再生苗的分子检测

2.3.1 再生苗的PCR分析

以CTAB法提取的4棵再生苗的总DNA为模板,用引物primer1和primer2进行扩增,结果如图3所示。PCR检测结果初步表明,目的基因peaT1已经整合到再生棉株2和4的基因组当中。

图3 棉花再生苗的PCR检测

2.3.2 再生苗的southern blot分析

从再生棉株2和4及PCR检测呈阴性的再生苗中提取DNA,进行southern杂交分析,如图4所示,质粒阳性对照及再生苗2和4均检测到杂交条带,其中再生苗4中目的基因为双拷贝插入,阴性对照没有杂交信号,表明目的基因peaT1已经整合到再生苗2和4基因组当中。

图4 棉花再生苗的southern blot分析

2.3.3 再生苗的RT-PCR分析

从PCR阳性株的叶片中提取总 RNA,以合成cDNA第1链为模板,primer1和primer2的PCR结果如图5所示,再生棉苗2和4均扩增到和阳性对照大小一致的条带,空白对照则没有目的条带,表明目的基因peaT1已经整合到再生苗2和4当中,并成功转录。

图5 再生苗的RT-PCR分析

3 讨论

棉花的农杆菌转化已经开展多年,并在许多品种上取得了成功。与其他作物相比,棉花组织培养受基因型限制,周期较长,体细胞胚胎发生困难等限制了其广泛应用[18]。组织培养中诱导出的胚性愈伤,在初次继代及随后胚状体诱导过程中会出现严重的褐化现象,导致胚性愈伤死亡。本研究中胚性愈伤继代时多伴有褐化现象,在培养基中添加活性炭和硝酸银一定程度上降低了褐化程度,需要进一步尝试更有效的办法避免或减轻褐化,以提高植株的再生率。针对棉花组织培养生根困难的问题,目前多采用嫁接法以缩短再生周期,保证再生苗的成活率。本研究采用劈接法嫁接再生苗,需要注意的是：嫁接过程中温度应控制在23～25℃[19],嫁接后浇水不宜过多,否则会引起砧木苗与土壤接触部分褐腐死亡,缓慢透气使幼嫩棉苗不易失水太快而引起萎蔫死亡,能保证嫁接苗的成活。

蛋白激发子pea T1是通过诱导植物自身免疫,达到抗病促生的作用,其不针对某一种或某一类病害,不会产生抗药性,对环境安全,应用前景广阔[20]。蛋白激发子基因pea T1与植物基因工程技术的广泛结合,将为培育具有广谱抗性的高产优质品种拓展更广阔的空间。

本研究采用农杆菌介导法,以棉花品种‘CCRI24’为受体材料,成功转化peaT1基因并得到再生苗,经分子生物学方法检测peaT1已经整合到棉花基因组当中,为开展激发子基因peaT1转化棉花的研究提供了基础材料。转peaT1基因的棉花能否产生对相关病害的抗性、表现出促进生长的功能,还需要进一步验证激发子基因peaT1在‘CCRI24’中的表达,综合分析转基因棉花的农艺性状、抗病性,期望能从转基因棉花后代中筛选到优良品种。

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