葫芦种子传黄瓜绿斑驳花叶病毒的检测*

秦碧霞, 蔡健和, 陆秀红, 林 林, 廖富荣, 刘志明

(1.广西农业科学院植物保护研究所,南宁 530007; 2.广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室,南宁 530007;3.广西玉林市农业科学研究所,玉林 537000; 4.厦门出入境检验检疫局,厦门 361012)

黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是烟草花叶病毒属(Tobamovirus)成员,是葫芦科重要病毒之一,1935年Ainsworth在英国首次发现和报道,随着葫芦科作物在各国间的交流引种日益频繁,目前该病毒在英国 、希腊、罗马尼亚、巴西 、日本 、伊朗 、印度、韩国等及中国部分地区均有分布[1-5],在一些地区已造成大田瓜类作物的毁灭性损失,严重威胁葫芦科作物安全生产[3-4,6-7]。2006年我国农业部(农业部公告第788号)已将该病毒确定为全国农业植物检疫性有害生物。

种子带毒是黄瓜绿斑驳花叶病毒远距离传播的主要途径,建立健全种子病毒检测方法,了解种子携带病毒情况,对从源头控制该病毒的扩散蔓延有重要指导意义。血清学检测及分子生物学检测是快速诊断该病毒的主要方法,酶联免疫吸附法(ELISA)广泛应用于黄瓜绿斑驳花叶病毒的检测,RT-PCR及免疫捕获RT-PCR(IC-RT-PCR)的应用使黄瓜绿斑驳花叶病毒的检测灵敏度大大提高[8-9],Lee[10]等利用生物芯片技术使黄瓜绿斑驳花叶病毒的检测更准确和快捷,邓丛良[11]等建立了实时荧光RT-PCR检测黄瓜绿斑驳花叶病毒方法,检测灵敏度比RTPCR高10倍。ELISA和RT-PCR、IC-RT-PCR已被广泛应用于黄瓜绿斑驳花叶病毒带毒种子的检测[12-15]。本文通过生物学、血清学及分子生物学方法测定了感染黄瓜绿斑驳花叶病毒的葫芦(Lagenaria siceraria)种子携带病毒的情况,并测定了种子各部位携带病毒的侵染活性及DAS-ELISA检测葫芦种子携带病毒的灵敏度。

1 材料与方法

1.1 供试材料

检测用种子是感染黄瓜绿斑驳花叶病毒并表现明显症状的葫芦植株留的种子,于2006年12月开瓜取种,经洗净晒干后保存在4℃冰箱备用,阳性对照为本实验室分离纯化接种保存在葫芦上的黄瓜绿斑驳花叶病毒,健康对照为健康葫芦植株收取的种子。

1.2 种子带毒率测定

1.2.1 苗期症状观察法

2007年3月和6月分别在防虫网室水泥池内播种供试葫芦种子150粒和100粒,观察至5～6叶期,记录发病株数,统计发病率,并用ELISA方法检测验证。

1.2.2 双抗体夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)

CGMMV抗血清、酶标抗体等购自美国Agdia公司。随机取30粒供试葫芦种子,每粒种子为1份样品,将种子剥开后加1ML 0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)和少量金刚砂研磨,低速离心取上清液进行检测,设感染CGMMV的葫芦叶片做阳性对照,健康葫芦叶片和种子为阴性对照,检测步骤及结果判断参照试剂说明书进行。

1.2.3 免疫捕获反转录PCR法(IC-RT-PCR)

根据黄静等[12]设计的CGMMV基因组保守序列合成上下游特异引物,上游引物CGM1：5′-CGTGGTAAGCGGCATTCTAAACCTC-3′,下游 引物CGM2 ：5′-CCGCAAACCAATGAGCAAACCG-3′,扩 增片段约 650 bp。AMV、RNasin、Taq DNA聚合酶、dNTPs等购自宝生物工程(大连)有限公司。

在0.2 ML PCR管中加入100μL用包被缓冲液稀释至工作浓度的CGMMV抗血清,37℃孵育2～3 h,倒净,PBST洗3次,每次 3 min,加入1.2.2制备的整粒种子研磨上清液100μL,37℃孵育2～3 h或4℃冰箱过夜,倒净,PBST洗3次,ddH 2O洗1次,吸尽余液,向管中加入 DEPC水11.5μL,5×RT buffer 4μL,dNTPs(10 mmoL/L)2μL,下游引物 CGM2(100μmol/L)1.0μL,混匀后 82 ℃4Min,迅速置冰上 3 min,加入 AMV(5U/μL)1.0μL,RNasin(40 U/μL)0.5 μL,总体积 20μL,混匀后42℃80Min,85℃10min。

PCR反应总体积20μL：ddH2 O 14.7μL,反转录产物1μL,10×PCR bu ffer 2μL、10mmoL/L dNTPs 0.2 μL、CGM1(10 μmol/L)、CGM2(10μmol/L)各1.0μL,Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.1μL,混匀后进行PCR扩增。扩增条件为：94℃预变性3 min,94℃变性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸1min,循环35次,最后72℃延伸10 Min,用1.2%琼脂糖电泳检测PCR产物。

1.3 种子不同部位病毒检测

分别取整粒种子、剥离的种皮及其对应的种仁各10粒用于检测,每粒为1份样品。种子及种皮分别用1ML磷酸盐缓冲液(0.1 mol/L,pH 7.4)浸泡2 h得到浸泡液,种仁加1 ML缓冲液研磨,低速离心后取上清液,分别用DAS-ELISA和IC-RT-PCR方法检测带毒情况。

1.4 DAS-ELISA检测灵敏度

取1粒病种(0.16 g),加3.2 ML磷酸盐缓冲液(pH 7.4),研磨后低速离心取上清液,按倍比法系列稀释至 40、80、160、320、640、1 280 、2 560、5 120、10 240倍,用DAS-ELISA检测,用安托斯全自动酶标仪(Anthos 2010)读取405 nm吸光值,根据待测样品与阴性对照的吸光值比值判断结果。出现阳性反应的最大稀释度即该法检测灵敏度。

1.5 种子携带病毒的侵染活性

分别取1.3制备的整粒种子表面(种表)、种皮浸泡液、种仁及整粒种子研磨上清液各接种葫芦8株,观察记录发病情况,并用ELISA检测验证。

2 结果与分析

2.1 种子带毒率测定

苗期症状观察法播种的两批种子分别成苗110株和89株,观察至6叶期,各有1株表现花叶症状,平均发病率为1.01%,经DAS-ELISA检测,显症植株与CGMMV抗血清呈阳性反应,随机抽取10株无症状植株进行检测,均与CGMMV抗血清呈阴性反应,未发现隐症带毒植株。葫芦种子携带CGMMV从种子到幼苗的传毒率为1.01%。

DAS-ELISA法检测结果表明,随机抽检的30粒病株种子全部与CGMMV抗血清呈阳性反应,健康种子呈阴性反应,感病葫芦种子带毒率100%。

IC-RT-PCR扩增产物经1%琼脂糖电泳检测,30份病株种子及阳性对照均扩增出约650 bp片段,与预期片段大小一致,健康对照无任何扩增条带(图1),与DAS-ELISA检测结果一致,感病葫芦种子带毒率100%。

图1 带毒葫芦种子IC-RT-PCR产物电泳结果

2.2 种子不同部位病毒检测

DAS-ELISA检测结果表明：10份种皮浸泡液及9份种仁研磨上清液与CGMMV抗血清呈阳性反应,1份种仁上清液及10份种表浸泡液与CGMMV抗血清呈阴性反应;IC-RT-PCR检测结果：种表浸泡液无预期片段扩增,种皮浸泡液及种仁研磨上清液均出现约650 bp预期片段(表1)。在抽检的10粒种子中,种子表面未检出CGMMV,种皮及种仁均检测到CGMMV。

表1 带毒种子不同部位检测结果

2.3 DAS-ELISA检测灵敏度

从表2看出,种子研磨上清液最大稀释至5 120倍仍与CGMMV抗血清呈阳性反应,相当于可以检测31.25μg带毒种子携带的CGMMV。

表2 种子研磨上清液不同稀释倍数检测结果1)

2.4 种子携带病毒的侵染活性

种表浸泡液接种的8株葫芦均生长正常,未表现任何症状,而种皮浸泡液、种仁及整粒种子研磨上清液分别接种的8株葫芦,各有6、5株和7株表现脉绿、斑驳花叶等典型CGMMV侵染症状,对显症与不显症的植株进行ELISA检测,结果与症状表现一致,说明种子各部位携带的CGMMV具有侵染活性。

3 结论与讨论

ELISA和IC-RT-PCR随机抽检 30粒感染CGMMV的葫芦植株种子带毒率为100%,播种出苗的199粒种子传毒率只有1.01%。Choi Gug-Seoun[16]检测感染CGMMV的葫芦种子带毒率为84%,传毒率为2%。由于种子传毒与否及种传率高低除与病毒本身有关外,还受植株品种、感染时期、环境条件及各种因素互作影响[17],因此不同批次的同品种种子带毒率和传毒率也不同,随机取样和抽取足量样本进行检测更能真实反映种子的带毒情况。有研究认为甘蔗花叶病毒(SCMV)存在于玉米种皮和胚乳中的病毒不是导致幼苗发病的主要原因,胚携带的病毒才是导致种子传毒的内在因素[18]。本研究在葫芦种子表面未检出CGMMV,可能是由于检测的样品少,或者表面病毒量少未能检出。葫芦种皮和种仁经检测携带CGMMV,但未对具体的带毒部位做进一步检测,CGMMV在葫芦种子上的传毒率与种子各部位携带病毒的关系及其传毒机理尚需进行更深入系统的研究。

种子传毒对病害的流行传播有重要影响,虽然至今未明确CGMMV的田间传毒媒介,但该病毒极易通过汁液摩擦、叶片接触、嫁接、农事操作等非介体传播[19],一旦田间出现因种子带毒发生的病苗,即使是很低的比例,也会以此为初侵染源,通过非介体因素传播开来,从而造成严重损失。此外,葫芦是我国很多西瓜产区用于嫁接防治枯萎病的主要砧木,葫芦种子带毒很容易通过嫁接传染接穗西瓜苗,从而扩散到大田引起严重的后果[3]。

CGMMV是我国农业植物检疫性有害生物和进境检疫性有害生物,由于该病毒极强的稳定性、具有广泛的适宜寄主和多种传播特性,在我国定殖和扩散的风险性极高[20]。DAS-ELISA和 RT-PCR(IC-RT-PCR)等方法已经成功应用于快速灵敏检测种子携带的 CGMMV[12-15],本研究表明 DASELISA检测葫芦种子CGMMV的灵敏度为1/5120种子研磨液。种子携带病毒的灭活处理也已经有很多成功的方法[13-14],当务之急是加强葫芦科种子检验检疫规程制定和监管,对商品用种和引进调运的种子进行消毒处理,加强抗病品种培育等,多途径阻断该病毒的传入、定殖及扩散危险,促进葫芦科作物生产持续、稳定、健康发展。

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