菌酶协同制备菜籽肽工艺的优化及其营养成分分析
2011-06-08姚晓红吴逸飞王新孙宏钱彬张博汤江武
姚晓红 吴逸飞 王新 孙宏 钱彬 张博 汤江武
我国是菜籽粕产量居世界第一的国家，每年产量可达近千万吨。菜籽粕营养丰富，粗蛋白含量达35%～45%，同时含有较丰富的Ca、Mg、P、Se及多种营养物质，其中Se含量在植物性蛋白中含量最高[1]。菜籽蛋白几乎不存在限制性氨基酸，且其氨基酸组成接近联合国粮农组织（FAO）和世界卫生组织（WHO）推荐值，是优良的天然植物蛋白资源[2]。但由于菜籽粕中含有硫代葡萄糖苷（硫苷）、植酸等抗营养物质[3]，降低了蛋白质（氨基酸）的消化利用率，极大地限制了其在畜禽日粮中的应用。
国内外学者曾采用微生物发酵法对菜籽粕进行脱毒，取得了显著效果；同时研究还发现，菜籽蛋白经微生物降解后可得到低分子量的菜籽肽。菜籽肽具有低抗原性、酸溶性、低黏度等特点，且在体内消化吸收快，能有效提高菜籽蛋白利用率[4]。目前，单一依靠微生物发酵所得菜籽肽含量较少。因此，本研究在前期获得优良脱毒菌株及最佳脱毒工艺的基础上，以菜籽蛋白降解为目标，尝试在微生物发酵脱毒的基础上添加中性蛋白酶，进行菌酶协同酵解工艺研究，以期扩大菜籽肽得率，为进一步提高菜籽粕的利用率提供支持。
1.材料与方法
1.1 原料及菌种
菜籽粕购自绍兴中大饲料有限公司，粗蛋白含量≥32%，硫苷含量≥35 μmol/g；中性蛋白酶购自Sigma 公司，酶活 500 U/mg；枯草芽孢杆菌 B1（Bacillus subtilis－B1）为本实验室筛选获得的高效硫苷降解菌，于－4℃保藏于斜面培养基。
1.2 培养基
斜面培养基：牛肉膏 5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、琼脂 2%，pH 值 7.0～7.2，H2O 1000 ml。
液体培养基：不加琼脂，其余成分与斜面培养基相同。
固态发酵培养基：菜籽粕100%、料水比1：1，pH值自然。
1.3 方法
1.3.1 菌种活化
无菌条件下接一环斜面菌种B1于液体培养基中，于37℃、200 r/min培养20 h，菌体浓度达108CFU/ml。
1.3.2 菜籽粕菌酶酵解的方法
称取100 g新鲜菜粕，加入100 ml H2O，按2%（菜籽粕干料重）的接种量、100 U/g(菜籽粕干料重)的加酶量加入活化液体菌液、中性蛋白酶（具体接种和加酶的方式见表1)，混合均匀，装入500 ml罐头瓶中，用无菌报纸封口，置于30℃培养48 h，分别在试验设定时间取出，50℃烘干至恒重，粉碎过80目筛待测。
1.3.3 单因素试验
设计4种不同的菌酶发酵菜粕方式（见表1）。以硫苷降解和肽含量为指标，在获得的最佳发酵方式下，以肽含量为指标，分别进行不同B1接种量(1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%)、不同酶添加量(50、100、150、200、250 U/g) 和不同料水比（1：0.8、1： 0.9、1： 1.0、1： 1.1、1：1.2）的单因素试验。
表1 菌酶发酵菜粕方式
1.3.4 正交试验
发酵工艺优化采用3因素3水平L9（33）正交试验，共设9个处理，每个处理3个重复，各参数水平根据单因素试验结果，选择接种量、酶添加量、料水比3个因素进行正交试验，随后筛选出优化组合。
1.3.5 检测方法
硫苷含量检测采用氯化钯分光光度法[5]；硫苷分解产物异硫氰酸酯(ITC)和噁唑烷硫酮(OZT)含量检测参照国家标准 GB 13087—91 GB 13089—91[6－7]；单宁含量检测参照国家标准GB/T 15686—2008[8]；植酸含量检测采用分光光度法[9]；粗蛋白含量检测采用凯氏定氮法[10]；菜籽肽含量检测：称取过80目筛的待测样品，加入等体积10%三氯乙酸(TCA)，在160 r/min下振荡30 min，而后4000 r/min离心15 min，取上清液采用Folin－酚法[11]测定蛋白质总量；菜粕蛋白分布采用SDS－PAGE凝胶电泳[12]；还原糖含量检测采用DNS分光光度法[11]；钙含量检测参照[13]GB/T 13885—2003，磷含量检测参照[14]GB/T 6437—2002。
1.4 数据统计分析
数据采用SPSS 13.0统计软件进行数据处理和方差分析,多重比较采用LSD法，显著水平为P＜0.05。
2 结果与分析
2.1 菌酶协同酵解菜粕方式的确定(见表2)
表2 发酵方式对菜籽肽和硫苷含量的影响
由表2可知，处理方式3，即菌酶同步发酵，在菜籽肽含量提高和硫苷降解方面，同时取得较好的效果，硫苷降解率达到68.10%，菜籽肽含量为140.78 mg/g，比发酵前提高了3.21倍。而处理4，即菌酶分步发酵方式，虽然菜籽肽含量的提高效果明显，但硫苷降解效果较差。因此，选择菌酶同步添加的方式进行协同酵解后续的单因素试验。
2.2 菌酶协同酵解条件研究
2.2.1 接种量对菜籽肽含量的影响(见图1)
图1 接种量对菜籽肽含量的影响
随着接种量的增加，菜籽肽含量呈现先增加、后下降的变化过程。当接种量为1.5%时，菜籽肽含量达156.4 mg/g，接种量为2%时，菜籽肽含量达164.3 mg/g，增加幅度不大，因此本试验选择适宜接种量为1.5%。
2.2.2 酶添加量对菜籽肽含量的影响(见图2)
图2表明，当中性蛋白酶添加量为100 U/g时，菜籽肽含量达到161.2 mg/g；当酶添加量为250 U/g时，菜籽肽含量最高，达166.4 mg/g，与添加100 U/g相比，增加幅度不大，考虑到加酶成本，本试验确定酶的适宜添加量为100 U/g。
图2 酶添加量对菜籽肽含量的影响
2.2.3 料水比对菜籽肽含量的影响(见图3)
图3 料水比对菜籽肽含量的影响
结果表明，随着发酵体系中水分含量的增加，菜籽肽含量呈逐渐增加的趋势，但考虑到含水率增加时，会显著影响到硫苷的脱毒效果，而料水比在1：1、1：1.1和1：1.2时，对菜籽肽含量的影响不大，因此确定最适料水比为1：1。
2.2.4 菌酶协同酵解条件的正交试验
以菜籽肽含量为指标，选取接种量、酶添加量和料水比进行3因素3水平正交试验试验，因素水平编码表和设计实施方案见表3。试验结果及方差分析见表4和表5。
表3 正交试验因素水平
正交试验的结果显示，接种量、酶添加量和料水比3个因素中，酶添加量和接种量是影响小肽含量的显著因素。3个因素对小肽含量的影响，依次为酶添加量>接种量>料水比。根据正交试验结果确定的最佳发酵条件为：接种量为1.0%，酶添加量为150 U/g，料水比为1：1.0。
表4 菌酶协同酵解正交试验设计及结果
表5 菌酶协同酵解正交试验的方差分析
2.3 菌酶协同酵解菜粕营养成分分析
根据正交试验得到的最佳条件，进行菌酶协同酵解菜籽粕，并对处理前后的菜籽粕进行了营养成分分析和蛋白凝胶电泳，结果见表6和图4。
表6 菜粕发酵后抗营养因子含量和营养成分分析
表6结果表明，经菌酶协同酵解后，菜粕中硫苷的含量为9.71 μmol/g，降解率达74.23%，其分解产物异硫氰酸酯（ITC）和噁唑烷硫酮（OZT）的含量分别比发酵前降低了79.07%和55.56%；发酵后菜粕中单宁和植酸含量分别降低了31.17%和16.39%；发酵后菜粕样品中粗蛋白含量达41.30%，比发酵前提高1.92%，菜籽肽含量达170.12 mg/g，比发酵前提高了3.7倍，还原糖含量达14.68%，比发酵前提高了57.68%，发酵后钙、磷含量分别达1.04%和1.35%，分别比发酵前提高了26.83%和11.57%。
图4 发酵菜粕样品的SDS-PAGE电泳图
SDS-PAGE电泳结果显示（见图4），与原菜粕相比较，菌酶协同酵解工艺处理后，菜籽蛋白的大分子量亚基均有不同程度降解，且高于25 kD的高分子肽链降解比较完全，另外，14.4 kD以下的蛋白条带已不存在，说明这些蛋白也被降解为分子量更小的蛋白了。
3 讨论
菜籽粕中存在较多的抗营养因子，其中硫苷是最主要的抗营养因子，其含量较高。物理法和化学法脱毒存在耗能高、蛋白损失大、成本昂贵[15-17]等缺陷限制了其使用，微生物发酵法脱毒因其在很多方面能克服物理和化学法的缺点而受到普遍的重视和应用。本试验中，采用微生物发酵协同酶解处理后，菜籽粕中硫苷的降解率达74.23%，与黄茜等[18]利用筛选获得的枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌和酿酒酵母进行菜粕发酵，得到硫苷的降解率达到89.06%的结果一致。同时，试验还表明，通过发酵可提高菜籽粕中的粗蛋白含量。刘军等[19]从土壤中分离出若干霉菌、酵母菌和细菌，对其中3支菌株混合发酵，结果菜粕的粗蛋白含量提高了23%；国外Adarsh Palvig[20]利用少孢根霉发酵菜籽饼粕也发现蛋白含量得到增加。试验证实了微生物发酵是改良菜籽粕的有效手段。
目前，对植物源蛋白及活性肽的研究日益成为食品、医药及饲料等领域的热点。本试验中小肽含量比发酵前提高了3.7倍，菜籽粕中还原糖、Ca、P含量分别比发酵前提高了57.68%、26.83%和11.57%。同时SDS-PAGE蛋白凝胶电泳结果也表明，菜粕经菌酶协同酵解后，蛋白组分中高于25 kD的大分子蛋白得到了较充分的降解。据报道，用蛋白酶酶解制备菜籽肽，可得到分子量较小的小肽，且蛋白水解度较高[21-22]。但作为饲料添加剂生产成本太高，同时酶解法对植物源蛋白中抗营养因子的去除效果并不理想。采用菌酶协同酵解法制备菜籽肽，枯草芽孢杆菌能分解其中的抗营养因子作为营养物质供自身的生长，从而达到脱毒的效果，同时外源蛋白酶与微生物发酵产生的酶，将大分子量的蛋白降解为小分子量的蛋白肽，可有效提高菜粕的品质及蛋白利用率，为菜籽粕的深入开发提供新的途径。
4 结论
本试验对菌酶协同酵解生产高品质菜粕的发酵工艺进行了研究，通过单因素及正交试验，确定了采用枯草芽孢杆菌与中性蛋白酶同步发酵的方式，当接种量为1.0%，酶添加量为150 U/g，料水比为1：1.0，发酵温度为35℃，发酵时间为48 h时，菜籽粕中硫代葡萄糖苷（硫苷）的降解率达74.23%，其分解产物异硫氰酸酯（ITC）和噁唑烷硫酮（OZT）的含量分别比发酵前降低了79.07%和55.56%；发酵后菜粕中单宁和植酸含量分别降低了31.17%和16.39%；发酵后菜籽粕中粗蛋白含量达41.30%，比发酵前提高1.92%，菜籽肽含量达170.12 mg/g，比发酵前提高了3.7倍，还原糖含量比发酵前提高了57.68%，钙、磷含量分别比发酵前提高了26.83%和11.57%。同时，SDS-PAGE电泳结果表明，菌酶协同酵解工艺处理后，菜籽蛋白中大分子量亚基均得到较好的降解效果。
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