谷胱甘肽拮抗锰致雄性大鼠生殖损伤的研究

王乾兴 金 华 张先平

1.贵州省遵义医学院细胞生物学与遗传学教研室(563003);2.贵州省习水县人民医院急诊科;3.贵州省遵义医学院组织胚胎学教研室

过量锰可导致人和动物睾丸生长发育与成熟的延迟、精液浓度和活性精子率降低，最终引起生精功能障碍等一系列生殖毒性［1～4］。本研究小组前期发现过量锰诱导的生精细胞凋亡与细胞内氧化应激有关［5］。谷胱甘肽(GSH)是细胞内重要的抗氧化剂，在抗氧化损伤中具有重要作用。为此，本实验采用锰对SD大鼠进行急性和亚急性染毒，然后投放GSH以观察其对锰染毒诱发的生精细胞凋亡及睾丸脂质过氧化产物——丙二醛(MDA)、抗氧化酶——谷胱甘肽过氧化物酶(GSH－Px)的影响，以探讨GSH对锰致雄性大鼠生殖损害的拮抗机理，为锰中毒的预防和治疗提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

由第三军医大学动物中心提供的清洁级健康雄性SD大鼠48只［合格证号:SCXK(渝)20020003］，体重150～180g，随机平均分为对照组、染锰组和GSH拮抗组。

1.2 主要试剂

MnCl2·4H2O(分析纯)购于中国医药集团上海化学试剂公司;GSH(分析纯)购于美国Sigma公司;TUNEL试剂盒购于德国Boechringer Mannheim公司;MDA和GSH－Px检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所。

1.3 模型建立与标本制备

染锰组和GSH拮抗组大鼠各分成两批，30mg/kg MnCl2·4H2O染锰1周(急性染毒)和4周(亚急性染毒)，再分别给予生理盐水(染锰组)和1mmol/kg GSH(GSH拮抗组)2周［6］，对照组给予生理盐水。以上各组动物的给药途径均为腹腔注射，1次/d，每周5d。停药后继续观察2周，分批处死动物，每组各8只，取双侧睾丸分别进行冷冻切片和制备组织匀浆。

1.4 TUNEL法检测生精细胞凋亡

冷冻切片置于4%多聚甲醛固定30min，PBS冲洗后入0.3%H2O2－甲醇溶液中封闭10min，PBS冲洗后，0.1%Triton X－100－0.1%枸橼酸钠溶液中冰浴2min，PBS冲洗后加TUNEL反应混合液，37℃孵育1h，PBS冲洗后加转化剂POD(37℃)反应30min，PBS冲洗，DAB显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜观察。同时设阴性对照和阳性对照(用10μg/ml DNAase I预处理切片)。以上各步均PBS冲洗5min×3次。

1.5 化学比色法检测睾丸MDA和GSH－Px活性

准确称取少量睾丸组织，加入生理盐水，超声粉碎制备1%组织匀浆，3 000rpm离心10min，用考马斯亮蓝法测定上清液组织蛋白浓度，按试剂盒说明书测定MDA和GSH－Px活性。

1.6 统计学分析

每张切片随机选择10个精细小管，计算生精细胞凋亡指数(AI)，即凋亡阳性生精细胞数/总生精细胞数。所有计数资料以±s表示，采用SPSS 17.0软件进行方差分析。

2 结果

2.1 GSH对急性与亚急性锰染毒大鼠生精细胞凋亡的影响

各组大鼠均可见以精原细胞和精母细胞为主的凋亡生精细胞(图1)，其细胞核呈棕褐色。急性锰染毒时，染锰组生精细胞AI明显高于对照组(P＜0.01)，GSH拮抗组生精细胞AI明显低于染锰组(P＜0.01)，且与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。亚急性锰染毒(4周)时，染锰组生精细胞AI明显高于对照组(P＜0.01)，GSH拮抗组生精细胞AI明显低于染锰组(P＜0.01)而高于对照组(P＜0.01)。见表1。

图1 大鼠生精细胞凋亡(TUNEL×200)

2.2 大鼠睾丸MDA含量和GSH－Px活性测定结果

急性锰染毒时，染锰组睾丸MDA含量明显高于对照组(P＜0.01)，GSH拮抗组睾丸MDA含量明显低于染锰组(P＜0.01)，而与对照组无差异(P＞0.05);GSH－Px活性在各组间比较均无差异(P＞0.05)。亚急性锰染毒时，染锰组睾丸MDA含量明显高于对照组(P＜0.01)，GSH拮抗组睾丸MDA含量明显低于染锰组(P＜0.01)，但仍明显高于对照组(P＜0.01);染锰组睾丸GSH－Px活性明显低于对照组(P＜0.01)，GSH拮抗组睾丸GSH－Px活性明显高于染锰组，而与对照组无统计学差异(P＞0.05)，见表1。

表1 GSH对不同时间锰染毒大鼠生精细胞AI及睾丸MDA含量和GSH－Px活性的影响(±s)

表1 GSH对不同时间锰染毒大鼠生精细胞AI及睾丸MDA含量和GSH－Px活性的影响(±s)

*与对照组比较P＜0.01 Δ与染锰组比较P＜0.01

对照组 0.39 ±0.09 0.50 ±0.11 33.56 ±3.49 0.48 ±0.010.60 ±0.12. 30.64 ±4.20染锰组 0.99 ±0.14* 1.15 ±0.22* 29.37 ±3.24 1.80 ±0.21* 2.44 ±0.49* 23.55 ±5.27*GSH 拮抗组 0.52±0.08Δ 0.64±0.15Δ 31.91±4.17 1.12±0.20*Δ 1.31±0.51*Δ 31.20±5.30Δ

3 讨论

过量锰可通过血－睾屏障蓄积在睾丸内，损伤生精功能，抑制精子发生。本研究组前期工作证实，过量锰可引起睾丸组织自由基生成增多，导致生精细胞凋亡增加［5］。自由基是生物体产生并损害自身的毒性产物，可引起脂质过氧化反应，产生脂质过氧化物。MDA是脂质过氧化的终产物，其含量反映机体脂质过氧化的速率及强度，可间接反映组织细胞受自由基损伤的程度［6］。GSH－Px是生物体内重要的抗氧化酶，能有效清除自由基、对抗自由基损伤。本研究发现，急性锰染毒时生精细胞AI增加，睾丸组织MDA含量升高，表明急性染锰可引起睾丸组织的脂质过氧化，产生过量的MDA，使生精细胞受损、凋亡增加。而在亚急性锰染毒时生精细胞AI与睾丸组织MDA含量进一步升高，GSH－Px活性进一步下降，提示随着染锰时间的延长，大鼠体内的脂质过氧化反应也在相应增强，MDA产量继续增加，消耗了大量如GSH–Px等的抗氧化物质，使睾丸氧化与抗氧化系统失衡，引起生精细胞凋亡增加，最终导致精子质量下降，降低生育力。

GSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的一种含巯基的天然三肽。其所含巯基是发挥作用的主要基团，在蛋白质和DNA合成、物质运输、新陈代谢及细胞保护等生物学功能中起着重要作用。GSH还是许多酶的辅基，参与体内三羧酸循环及糖代谢，具有抗氧化、解毒、抗癌及消除疲劳等作用［7～9］。人体在衰老、感染、中毒、外源性毒素、氧化应激等状态下，细胞内GSH生物合成能力降低、含量下降。因此，病理状态下内源性GSH减少时，适时补充外源性GSH便成为必需，可以预防、减轻或终止组织细胞的损伤，改变病理生理过程。研究表明GSH对砷诱导的血管内皮细胞凋亡有保护作用［10］。本实验结果发现，大鼠急性锰染毒后给予GSH，生精细胞AI与睾丸MDA均恢复至正常水平，提示GSH能减轻急性锰染毒引起的睾丸脂质过氧化损伤，对生精细胞起到有效的保护作用。其机制可能为:第一，通过巯基与体内的自由基结合，使其转化成易代谢的酸类物质，从而加速自由基的排泄;第二，可以中和氧自由基，避免活性氧和氧自由基引起的脂质过氧化，从而避免细胞的损伤;第三，GSH含有的谷氨酰胺键，可维持细胞内分子的稳定性，减轻自由基对分子的损伤［11］。

本实验还显示，亚急性锰染毒后给予GSH，大鼠睾丸GSH－Px活性恢复至正常水平，MDA浓度和生精细胞AI虽然明显下降，但并不能恢复至正常水平，提示GSH对锰染毒的拮抗作用是有一定限度的，可能随着锰染毒时间的延长，大鼠抗氧化能力的持续消弱已经造成了睾丸组织的不可逆性损伤，GSH－Px活性的恢复可能是由于其底物GSH增加而造成的。也可能在生精细胞的抗氧化过程中，其它抗氧化酶，如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)在发挥着更重要的作用。综上所述，过量锰可诱导生精细胞凋亡，造成生精功能障碍，及时补充GSH可预防或减轻锰染毒所致的生精障碍的发生。

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