补体C3在男性不育患者血浆蛋白中的差异分布

辛 玲 朱晓红 韩丽媛 郭 颖 于和鸣 王慧萍，*

1.国家人口计生委科学技术研究所(北京，100081);2.北京协和医学院研究生院

世界卫生组织预测，男性不育症将成为21世纪危害人类健康最为严重的三大疾病之一。我国育龄夫妇不孕不育率攀升到10% ～15%，接近发达国家(15% ～20%)水平。其中，男性不育因素占不孕不育症的40%，且影响男性生育力的危险因素仍在增加［1］。在男性不育的病因中以少精子症、弱精子症和无精子症为主，而引发原因有多种，如内分泌因素、遗传因素及免疫因素等。血液是人体中重要的体液，血浆蛋白成分很复杂，机体功能异常时，血浆蛋白则会发生一定的变化［2］。本文利用电泳分离技术及质谱鉴定技术，对144例男性不育患者血浆与10例正常捐精者血浆蛋白进行分离，分析鉴定了男性不育患者与正常捐精者的血浆差异蛋白，为深入了解男性不育的发病机理奠定基础。

1 对象与方法

1.1 研究对象

10例正常捐精者血浆样本，来源于国家人口计生委科学技术研究所精子库捐献者，年龄24～30岁，其所捐精液数量、密度、活动率和形态分析等均在世界卫生组织所列正常范围之内［3］。144例男性不育患者血浆样本，来源于国家人口计生委科学技术研究所门诊，年龄25～32岁。均为婚后正常性生活未避孕2年以上不育者(经检查女方生育能力正常)，无外伤及遗传性疾病家族史，无性功能障碍病史，无泌尿、生殖、造血系统及内分泌疾病，排除曾患其他慢性疾病、隐睾症、性功能低下，未曾进行放疗或化疗，精液初步检查结果显示为无精子症或少精子症。

1.2 实验材料

丙烯酰胺、二硫苏糖醇(DTT)和碘乙酰胺(IAA)(Merk公司);甲叉双丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠(SDS)、尿素、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸及考马斯亮蓝G－250染料(USB公司);过硫酸铵(AP)和α－氰－4－羟基肉桂酸(CHCA)(Sigma公司);溴酚蓝(Amresco公司);四甲基乙二胺(Amersham公司);胰蛋白酶(Roche公司);乙腈(ACN)(Fisher公司);碳酸氢铵(Fluka公司);三氟乙酸(Tedia公司)。其他试剂均为国产分析纯(北京化学试剂公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 血浆蛋白定量 将血液样本于4℃，2 000g离心15min，分离出血浆后，用Bradford法测定血浆蛋白浓度，血浆分装并贮存于－80℃冷冻备用。

1.3.2 血浆蛋白分离－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE) 将正常捐精者血浆及最初收集的2例男性不育患者血浆用6%的SDS聚丙烯酰胺凝胶进行一维电泳分离，上层浓缩胶浓度为4%。根据所测的蛋白浓度计算样品上样体积，上样终体积为20μl，其中含4μl 5×上样缓冲液，DTT终浓度为100mM，ddH2O补足至终体积，充分混匀后在沸水水浴中加热变性5min。用微量上样器将预染分子量标准品和蛋白样品分别上样，60V恒压30min使样品集于浓缩胶底端，后用150V恒压至溴酚蓝前沿距胶底部0.5cm时停止电泳。蛋白上样量为80μg。凝胶结束后进行考马斯亮蓝G－250染色。

1.3.3 凝胶图像扫描分析 利用凝胶成像分析系统JY04S－3C对SDS－PAGE胶图采集、保存和分析。

1.3.4 蛋白鉴定 切取差异条带成1mm×1mm的胶粒，在25mM NH4HCO3/50%ACN中脱色，100%ACN胶粒脱水，经过10mM DTT/25mM NH4HCO3，56℃恒温水浴1h，和25mM IAA/25mM NH4HCO3室温避光孵育45min，加入适量胰蛋白酶(12.5 ng/μl)，4℃放置1h后，37℃酶切过夜(12 ～16h)，取酶切产物1μl和1μl CHCA基质混合后进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI－TOF/TOFMS)鉴定(4800 MALDI－TOF/TOF质谱仪，AB公司)。

1.3.5 差异条带验证分析 将剩余142例男性不育患者血浆按照1.3.2进行高分子量蛋白分离。

2 实验结果

2.1 不育患者与健康捐精者血浆蛋白SDS－PAGE

将2例不育患者与健康捐精者的血浆利用6%低浓度SDS－PAGE凝胶进行高分子量蛋白分离后，凝胶扫描结果见图1。如图所示，高分子量(Mr＞95 kD)血浆蛋白SDS－PAGE胶图中，在分子量200 kD及120 kD处分别出现了差异蛋白条带(条带a和条带b)。其中条带a仅在图1中的正常捐精者(图1中的第3、4、5及8泳道)出现，条带b在不育患者(图1中的第1和2泳道)非常明显。

图1 2例不育患者与5例正常捐精者血浆蛋白SDS－PAGE电泳图

2.2 质谱鉴定

两条差异条带经MALDI－TOF/TOF质谱鉴定后，利用MASCOT软件在SWISS－PROT蛋白质数据库中对质谱结果进行检索，鉴定结果均为补体C3，质谱图及检索鉴定结果见图2。根据数据库蛋白理论分子量及SDS－PAGE所显示的蛋白条带，初步认为图1中蛋白条带a和b是补体C3的不同片段形式。

2.3 差异蛋白验证

收集的另外142份不育患者血浆蛋白分离结果见图3。结果显示，患者血浆SDS－PAGE胶图中出现差异条带(同时出现 a和 b)的有 135例(93.75%)。

3 讨论

男性不育的发病机制尚不十分清楚，随着其发病率的增加，引起了广大科研工作者的关注。在无精子症、少精子症及弱精子症的研究中，大多采用分子生物学技术，以寻找其差异基因表达谱的改变。蛋白质作为三大生命大分子之一，参与体内的各种生命活动。随着蛋白质组学的发展，疾病状态下蛋白质的变化及差异成为研究热点［4，5］。血液是人体的一种重要体液，也是临床检查最常用的标本，血液检测以分泌性蛋白为主，血浆蛋白占重要地位。机体出现异常或发生病变时，常通过血浆蛋白的变化反映出来，因此血浆蛋白的变化也成为临床诊断、干预治疗及预后评估的基础。为此，我们设计此实验以找寻男性不育与正常人血液中的差异表达蛋白，以期深层探讨不育机制，为临床诊断和治疗提供理论依据。

本实验利用低浓度凝胶电泳去除血浆中高丰度的白蛋白，以获得丰度相对较低的高分子蛋白。对收集的所有144例不育患者与正常人的血浆蛋白进行凝胶分离并利用凝胶成像系统分析对比差异，结果发现在高分子量血浆蛋白中，有两条明显的差异条带(约为200 kD及120 kD处)，质谱鉴定结果为补体C3。

补体是一组具有酶原活性的糖蛋白，C3在补体系统中含量十分丰富，且发挥重要作用。补体C3可被抗原－抗体复合物及其他许多因子所激活，从而产生相应的生物学效应。在生殖系统中也有相关的研究报道，在女性不育伴有子宫内膜异位患者中，血清补体C3、C4及SC5b－9补体复合物处于高水平。不育男性精浆C3含量高于正常生育男性［6，7］。本研究发现男性不育患者血浆中补体C3条带染色深于正常捐精者蛋白条带，但血浆中准确的含量变化还有待验证。通过SWISS－PROT蛋白数据库检索到的补体C3理论分子量大约为190kD，由于补体C3本身是一种糖蛋白，有一定的糖基修饰，故本实验凝胶结果显示接近200kD处的条带应为补体C3。另外，补体C3在机体的补体系统中发挥作用时，往往有不同的片段形式［6］，这也解释了实验结果中条带b(图1)的存在。

本实验利用简单的低浓度SDS－PAGE分离技术，对血浆高分子量蛋白进行分离，发现了补体C3在不育患者与所选捐精者血浆中的差异，该现象提示不育患者的血浆蛋白出现了一定的变化，但相关机制及其与精浆/精液质量的相关性有待进一步验证。我们将通过继续扩大样本量及定量检测补体C3的血浆含量变化，以对补体C3蛋白条带的差异做进一步研究。

1 Povey AC，Stocks SJ.Epidemiology and trends in males fertility［J］.Hum Fertil，2010，13(4):182－188.

2 Zhang R，Barker L，Pinchev D，et al.Mining biomarkers in human sera using proteomic tools［J］.Proteomics，2004，4(1):244－256.

3 World Health Organization.WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen［M］.5th ed.Geneva:World Health Organization，2010.

4 Veenstra TD，Conrads TP，Hood BL，et al.Biomarkers mining the biofluid proteome［J］.Mol Cell Proteomics，2005，4(4):409－418.

5 Xiao Z，Prieto D，Conrads TP，et al.Proteomic patterns their potential for disease diagnosis［J］.Mol Cell Endocrinol，2005，230(1－2):95－106.

6 Kabut J，Kondera－Anasz Z，Sikora J，et al.Levels of complement components iC3b，C3c，C4，and SC5b－9 in peritoneal fluid and serum of infertile women with endometriosis［J］.Fertil Steril，2007，88(5):1298－1303.

7 Harris CL，Mizuno M，Morgan BP.Complement and complement regulators in the male reproductive system［J］.Mol Immunol，2006，43(1－2):57－67.